Estoques de algas, para ensaios de toxicidade, devem ser inoculados na fase de crescimento exponencial, pois mais de 99% das células encontram-se vivas e saudáveis durante esta fase (WALSH & ALEXANDER, 1980; USEPA, 1988). A densidade celular inicial é o maior fator que pode alterar a taxa de crescimento. Se o ensaio é iniciado com alta concentração de células, devido ao avanço da fase exponencial, o crescimento pode ser limitado em estágios mais avançados, provavelmente, devido ao sombreamento ou à limitação de CO2 e nutrientes (OECD, 2006; ASTM, 2007;
ALTENBURGER et al., 2010). Ainda segundo Altenburger et al. (2010), valores de CE50 variam sistematicamente de acordo com a densidade do inóculo de alga utilizada no início do experimento. Portanto, deve-se estabelecer uma densidade inicial fixa, baixa e na fase de crescimento exponencial, permitindo altas taxas de crescimento durante o teste.
A tabela 2 mostra as taxas de crescimento obtidas nos controles de cada teste, em cada intervalo de tempo, onde podem ser verificado aumento das taxas ao longo dos dias dos ensaios, mas com pequena variação. Indicando que os controles se mantiveram em crescimento exponencial, validando os testes. Ainda nesta tabela, observam-se taxas quase nulas com apenas 24 horas de teste, isto se deve ao fato da população algal se encontrar na fase lag, o qual é um período de latência variável, onde ainda não há aumento tão significativo da população em fase de adaptação às novas condições a que foi submetida. A fase lag pode ser observada também na figura 7. A duração desta fase pode ser crítica para o sucesso, pois pode determinar a duração do teste. Para minimizar a duração desta fase, as culturas devem ser iniciadas com o número adequado de células a partir da cultura estoque, a qual deve estar na fase de crescimento exponencial (USEPA, 1988; OECD, 2006; ASTM, 2007).
No presente estudo, foi estabelecida a concentração inicial de 1x10⁴ cel/mL e, como não foram verificadas diferenças significativas entre os pontos e o controle no tempo inicial (0 hora- tabela 1), os resultados obtidos em 72 horas não tiveram influência de possíveis variações de inóculo. A ASTM (2007) recomenda que o inóculo inicial, para espécies de água salgada, deva estar em uma concentração entre 1-2x10⁴ cel/mL. Arenzon & Raya-Rodriguez (2006), ao avaliarem a toxicidade de águas
subterrâneas, também utilizou um inóculo de 1x10⁴ cel/mL da Pseudokirchneriella subcapitata, em um volume final de 100 mL por réplica.
Já Achuthankutty (2000), em ensaio para avaliar o desempenho da cultura mista de Isochrysis galbana e Chaetoceros calcitrans em comparação com suas monoculturas, iniciou todas as culturas com a mesma concentração de inóculo, 2,5x10⁴ células/mL para cada espécie individual e 1,25x10⁴ células/mL de cada espécie para a cultura mista. Ao comparar o desempenho da microalga Pseudokirchneriella subcapitata com mais três organismos-teste, Radix et al. (2000) utilizaram um inóculo inicial de 5x105 em volume final de 50 mL. Mauffret et al. (2010) inocularam 105 células/mL da diatomácea bentônica Cylindrotheca closterium em sedimento e água do mar expostos ao LAS (linear alkylbenzene sulfonates). Altenburger et al. (2010), realizou todos os experimentos na concentração inicial de 5x104 células/mL.
Como alguns exemplos já citados, os testes de toxicidade com microalgas são realizados, geralmente, em volume final de 100 mL (RODRIGUES, 2002; ARENZON & RAYA-RODRIGUEZ, 2006; ALTENBURGER et al., 2010) outros em 50 mL (RADIX et al., 2000). Desta forma, tornou-se necessária a comparação dos resultados em volume final de 10 mL. Após a comparação dos volumes, todos os testes com T. weissflogii foram executados em tubos de ensaio contendo um volume de 10 mL de solução-teste, visto que não alteraria os resultados para o crescimento celular e CE50. Adaptando, assim, a metodologia para testes com microalgas, com a finalidade de padronizar ao teste com L. variegatus, além de reduzir o volume das amostras coletadas e armazenadas em laboratório e o espaço físico necessário para a realização e manutenção dos testes.
Os resultados obtidos a partir dos dados de densidade e por comparação das taxas de crescimento demonstraram que a duração ideal do teste com a microalga Thalassiosira weissflogii é de 72 horas, corroborando com a USEPA (1988), OECD (2006) e ISO 10253 (2006) que aconselham que a duração do teste para microalgas não seja maior que 72 horas, tempo em que o controle se encontra com as densidades populacionais baixas e as taxas de crescimento elevadas, podendo ser comparado às amostras ambientais (tabela2, tabela3 e figura7). A USEPA (1987) também indica a duração de 72 horas para testes com a T. weissflogii.
Como as algas apresentam uma rápida resposta fisiológica, os efeitos deletérios, em resposta a compostos tóxicos, podem ser detectados num curto período de tempo (SICKO-GOAD & STOERMER, 1988). Além disso, os testes de toxicidade crônica que exigem maior duração do ciclo de vida do organismo-teste são caros e requerem mão de obra intensiva (RADIX et al., 2000). Desta forma, Radix et al. (2000) avaliaram a toxicidade de P. subcapitata em um período de incubação de 5 horas e em 72 horas e sugeriram que a redução do tempo de exposição não substitui os testes com duração de 72h. As medições em 5 horas de incubação, quando a toxicidade foi detectada, geralmente forneciam as mesmas respostas que a contagem de células 72-h. No entanto, a ausência de resposta em vários casos não foi uma garantia de segurança, corroborando com os dados do presente estudo, o qual obteve melhores respostas em 72 horas de teste, para a microalga T. weissflogii (Tabela 1). Como todos os pontos que diferiram significativamente nos demais tempos (24h, 48h e 96h) também se refletiram em 72 horas, com exceção do P5 para o mês de novembro de 2010 (em 24 horas), este procedimento poderia ser usado para verificar rapidamente resultados positivos para
toxicidade, porém pode fornecer falsas respostas negativas para toxicidade, que não podem ser excluídos, como afirma Radix et al (2000).
O protocolo OECD (2006) requer uma taxa de crescimento mínima de 0,92/dia para o período de 72 horas de ensaio e o protocolo ISO 8692 (2004) requer uma taxa de crescimento de pelo menos um 1,4/dia. Já a ASTM (2007) sugere uma taxa de crescimento de pelo menos 0,9/dia, em 72h. O presente trabalho encontrou taxas de crescimento, nos meses analisados, acima das taxas mínimas exigidas com exceção para julho de 2010, como pode ser verificado na tabela 2.