3. MATERIAL E MÉTODOS
3.7. Análises moleculares das espécies neotropicais de Allophylus L
3.7.3 Alinhamento, análises filogenéticas e barcoding
As sequências obtidas foram primeiramente editadas e complementadas utilizando-se o programa Codon Code Aligner 4.2 e 5.0.1 (Codon Code Corporation 2013, 2014) e alinhadas inicialmente com a ajuda dos programas Clustal X 2.1 (Thompson et al. 2007), BioEdit (Hall, 1999) e MEGA4 – Molecular Evolutionary Genetics Analysis 4.0 (Tamura, et al. 2007). Para detecção de contaminantes e/ou direção correta das sequências foram utilizados scripts desenvolvidos pelo Prof. Dr. Pedro Dias (Universidade de São Paulo, dados não publicados) em conjunto com o BLAST (Altschul
et al. 1990).
Para as análises filogenéticas foram realizadas análises independentes para o ITS e o trnL-F. As análises de máxima parcimônia foram efetuadas com o programa PAUP* (Swofford, 2002), de acordo com os critérios da parcimônia apresentados por Fitch
38 (1971), através de buscas heurísticas com 10000 réplicas usando sequência de adiçao aleatória e TBR (Tree-bisection-reconnection) para a permutação de ramos. O suporte dos ramos foi estimado através de bootstrap não-parametrico (Felsenstein, 1985) baseado em 1000 réplicas e utilizando os mesmos parâmetros usados nas buscas de árvores.
Para as analises bayesianas, os modelos foram estimados a partir dos próprios dados com o MrBayes (Ronquist and Huelsenbeck, 2003, comandos lset e unlink), mantendo todos os parâmetros livres, permitindo que os mesmos fossem otimizados independentemente para cada partição (ITS e trnL-F). O modelo escolhido foi equivalente ao GTR (Lanave et al. 1984; Tavare, 1986) com distribuição gamma e proporção de sítios invariáveis (GTR + Γ + I), porém com parâmetros livres. As buscas de árvores foram feitas com o MrBayes (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) com quatro rodadas paralelas, cada uma com quatro cadeias (uma aquecida e três frias), totalizando 16 cadeias simultâneas durante 10 milhões de interações, com amostras a cada 100 iterações. Para a publicação dos dados obtidos nas análises filogenéticas, o número de interações será aumentado para 50 milhões a cada 100 interações.
O burn in foi estimado através do fator de convergência fornecido pelo próprio MrBayes e também com o pacote Coda (Plummer et al., 2007) no R (R Development Core Team, 2014). As probabilidades posteriores dos ramos foram assumidas como medida de suporte. Para as estimativas de suporte, foram adotadas as seguintes definições: sem suporte (< 50%), suporte fraco (≥ 50% até < 75%), suporte moderado (≥ 75% até < 95%), e suporte forte (≥ 95%). Esses valores foram decididos pelos autores do presente trabalho.
39 Com relação ao teste da metodologia de barcoding para as espécies neotropicais de Allophylus, foram utilizados indivíduos daquelas espécies que apresentam mais de um sequência nas análises filogenéticas e que geralmente formaram clados. Uma vez decidido quais as espécies fariam parte deste teste, cada sequência foi comparada através do BLASTn (Nucleotide BLAST: Align two or more sequences using BLAST- NCBI, 2014) com as outras sequências de indivíduos da mesma espécie. Essas comparações servem de base para a identificação do grau de similaridade (identity) entre sequências da mesma espécie.
Em seguida, utilizando-se as mesmas espécies que apresentaram indícios de monofiletismo na maioria das análises filogenéticas, as sequências de indivíduos de uma delas foi comparada com uma sequência dos indivíduos de uma segunda espécie. A seguir, esse processo foi repetido com todas as espécies que fazem parte deste teste.
Como resultado, buscou-se através da porcentagem de similaridade (identity) entre os pares de base das sequências comparadas, altos índices de igualdade. Entre indivíduos da mesma espécie, o grau de similaridade (identity) entre as sequências, para que a metodologia de barcoding fosse satisfatória seria ≥ 98-100% e para que através da mesma metodologia, as diferenças encontradas nas sequências, a similaridade entre elas deveria ser de 97% (≤97.9%) ou menos. No estudo entre diferentes espécies de
Allophylus e espécies de gêneros diferentes os mesmos índices foram utilizados. Para a
análise entre as espécies, foi escolhida para cada táxon o indivíduo que serviu como base para as comparações entre indivíduos do mesmo táxon da primeira análise e anotados, com relação a cada outro indivíduo das outras espécies presentes no estudo, os mesmos índices.
40 Para complementar os testes, foram comparadas também sequências de espécies africanas de Allophylus (A. ferrugineus e A. rubifolius) e de espécies de outros gêneros quando possível. Essas comparações servirão também para saber se o funcionamento da identificação de espécies pela comparação de sequências de DNA em outros integrantes da família Sapindaceae funciona e como exemplo, qual é a similaridade entre as sequências dos integrantes de Allophylus e do gênero mais próximo, Thouinia.
41 Tabela 2. Espécies e voucher para Allophylus utilizadas nas análises moleculares - ITS.
Espécies amostradas Local de Coleta Voucher Data de Coleta
A. abyssinicus Etiópia D. Desissa & Binggeli 318 ---
A. arboreus Madagascar S. Wohlhaus & Stiefel 60072 ---
A. bicruris Mayotte F. Barthelat 828 ---
A. boinensis Madagascar P. Rakotomalaza 655 11.III.1996
A. bojerianus Madagascar F. Ratovoson 961 9.II.2005
A. chaunostachys Tanzânia M. Mwangok & Mduvike 729 28.VI.1999
A. chirindensis Tanzânia I. R. Hizza 26 29.VI.1997
A. cominia México P. Acevedo-Rodríguez 12216 28.VI.2002
A. cominia Jamaica P. Acevedo-Rodríguez 9667 24.VII.1997
A. cominia México P. Acevedo-Rodríguez 12180 26.VI.2002
A. cominia México P. Acevedo-Rodríguez 15124 11.X.2009
A. comorensis Mayotte F. Barthelat 1540 ---
A. crassinervis --- Sem Voucher
A. decipiens Africa do Sul P. Phillipson 4194 ---
A. dissectus Madagascar P. Phillipson 1704 ---
A. divaricatus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 518a V.2011
A. divaricatus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 518b V.2011
A. divaricatus Porto Acre - AC R. L. G. Coelho 540 V.2011
A. edulis São M. do Sul- PR R. L. G. Coelho 390 II.2011
A. edulis Blumenau - SC R. L. G. Coelho 413 II.2011
A. edulis Videira - SC R. L. G. Coelho 398 II.2011
A. edulis Blumenau - SC R. L. G. Coelho 417 II.2011
A. ferrugineus Tanzânia G. Simon 458 ---
A. ferrugineus Tanzânia J. MLangwa 1458 22.III.2001
A. gardneri Mayotte M. Pignal 1834 ---
A. glabratus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 508 V.2011
A. glabratus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 511 V.2011
A. glabratus Rio Branco - AC R. L. G. Coelho 496 V.2011
A. hirtellus Camarões M. Cheek 5059 ---
A. latifolius Manaus - AM R. L. G. Coelho 276 12.VII.2010
A. latifolius Guiana Francesa S. Mori, 25304 5.V.2001
A. megaphyllus Camarões A. Leeuwenberg 9460 ---
A. pervillei Mayotte P. Hoffmann 399 ---
A. petiolulatus Blumenau - SC R. L. G. Coelho 416 II.2011
A. pougouensis Gabão G. McPherson 16109 30.I.1993
A. puberulus Esplanada - BA R. L. G. Coelho 440 IV.2011
A. puberulus Brasil Somner & Ferruci, 1069 ---
A. puberulus Conde - BA R. L. G. Coelho 441 IV.2011
A. punctatus Rio Branco - AC R. L. G. Coelho 447 V.2011
A. punctatus Rio Branco - AC R. L. G. Coelho 547 V.2011
A. punctatus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 517 V.2011
A. racemosus Ipatinga -MG Coelho, R. L. G. 424 III.2011
A. racemosus Caratinga - MG Coelho, R. L. G. 426 III.2011
A. rubifolius Tanzânia A. Mkeye 800 27.VI.1997
A. rubifolius Tanzânia P. Kuchar 23357 2.IV.2000
A. semidentatus Una -BA R. L. G. Coelho 428 IV.2011
A. semidentatus Ponte Nova -MG R. L. G. Coelho 427 III.2011
A. semidentatus Ilhéus - BA R. L. G. Coelho 434 IV.2011
A. strictus Porto Acre - AC R. L. G. Coelho 543 V.2011
42 Tabela 3. Espécies e voucher para Allophylus utilizadas nas análises moleculares – trnL-F.
Espécies amostradas Local de Coleta Voucher Data de Coleta
A. abyssinicus Etiópia D. Desissa & Binggeli 318 --- A. arboreus Madagascar S. Wohlhaus & Stiefel 60072 ---
A. bicruris Mayotte F. Barthelat 828 ---
A. bojerianus Madagascar F. Ratovoson 961 9.II.2005
A. chirindensis Tanzânia I. R. Hizza 26 29.VI.1997
A. cominia México P. Acevedo-Rodríguez 12216 28.VI.2002 A. cominia México P. Acevedo-Rodríguez 12180 26.VI.2002 A. cominia México P. Acevedo-Rodríguez 15124 11.X.2009
A. comorensis Mayotte F. Barthelat 1540 ---
A. crassinervis --- Sem Voucher
A. decipiens Africa do Sul P. Phillipson 4194 ---
A. dissectus Madagascar P. Phillipson 1704 ---
A. divaricatus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 518 V.2011 A. divaricatus Porto Acre - AC R. L. G. Coelho 540 V.2011 A. edulis São M. do Sul- PR R. L. G. Coelho 390 II.2011
A. edulis Blumenau - SC R. L. G. Coelho 413 II.2011
A. edulis Videira - SC R. L. G. Coelho 398 II.2011
A. ferrugineus Tanzânia G. Simon 458 ---
A. ferrugineus Tanzânia J. MLangwa 1458 22.III.2001
A. gardneri Mayotte M. Pignal 1834 ---
A. glabratus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 511 V.2011
A. hirtellus Camarões M. Cheek 5059 ---
A. latifolius Manaus - AM R. L. G. Coelho 276 12.VII.2010
A. megaphyllus Camarões A. Leeuwenberg 9460 ---
A. pervillei Mayotte P. Hoffmann 399 ---
A. pougouensis Gabão G. McPherson 16109 30.I.1993
A. puberulus Esplanada - BA R. L. G. Coelho 440 IV.2011 A. puberulus Brasil Somner & Ferruci, 1069 --- A. punctatus Rio Branco - AC R. L. G. Coelho 547 V.2011 A. punctatus Rio Branco - AC R. L. G. Coelho 447 V.2011
A. punctatus Xapuri - AC R. L. G. Coelho 517 V.2011
A. racemosus Ipatinga -MG Coelho, R. L. G. 424 III.2011 A. robustus Guiana Francesa P. Acevedo-Rodríguez 11108 7.VII.2000
A. rubifolius Tanzânia P. Kuchar 23357 2.IV.2000
A. semidentatus Una -BA R. L. G. Coelho 428 IV.2011
A. semidentatus Ponte Nova -MG R. L. G. Coelho 427 III.2011 A. semidentatus Ilhéus - BA R. L. G. Coelho 434 IV.2011 A. strictus Porto Acre - AC R. L. G. Coelho 543 V.2011 A. timorensis --- L382
43 Tabela 4. Espécies e voucher para integrantes dos demais gêneros de Sapindaceae utilizados nas análises moleculares – ITS.
Espécies amostradas País de
Coleta Voucher GenBank no ITS
Athyana weinmannifolia Peru Pennington 17581 EU720487
Athyana weinmannifolia Peru Acevedo-Rodríguez, P. 11166 --- Cardiospermum corindum Zâmbia D. Hader & Bringham 3495 --- Cardiospermum
grandiflorum
Uganda ATPB 603 ---
Cardiospermum urvilleoides Brasil J. Urdampilleta 425 --- Houssayanthus biternatus México C. Catalan & Teran 837 --- Houssayanthus incanus Brasil M. S. Ferrucci 2710 --- Melicoccus lepidopetalus Bolívia Acevedo-Rodríguez, P. 11128 EU720443
Paullinia alata --- B8212 ---
Paullinia clavigera Brasil P. Acevedo-Rodríguez 14841 --- Paullinia elegans Brasil P. Acevedo-Rodríguez 11135 --- Serjania caracasana Guiana P. Acevedo-Rodríguez 3483 ---
Serjania communis Bogor Chase 2138 EU720472
Serjania glabrata Peru Merello 1058 EU720557
Talisia angustifolia Paraguai E. M. Zardini 43668 EU720558
Talisia nervosa --- Pennington 628 EU720474
Thinouia sp. México P. Acevedo-Rodríguez 12354 ---
Thouinia acuminata México A. Liston 633-2 EU720478
Thouinia portoricensis Porto Rico P. Acevedo-Rodríguez 11435 --- Thouinia trifoliata República
Dominicana
P. Acevedo-Rodríguez 14056 ---
Thouinia villosa México G. Hall 825 ---
Urvillea chacoensis Argentina A. H. Keller 6834 --- Urvillea rufescens Brasil Somner & Ferrucci, 1073 --- Urvillea ulmacea México P. Acevedo-Rodríguez 15145 ---
44 Tabela 5. Espécies e voucher para integrantes dos demais gêneros de Sapindaceae utilizados nas análises moleculares – trnL-F.
Espécies amostradas País de
Coleta Voucher GenBank no ITS
Athyana weinmannifolia Peru Acevedo-Rodríguez, P. 11166 --- Cardiospermum corindum Zâmbia D. Hader & Bringham 3495 --- Cardiospermum
grandiflorum
Uganda ATPB 603 ---
Cardiospermum urvilleoides Brasil J. Urdampilleta 425 --- Houssayanthus biternatus México C. Catalan & Teran 837 --- Houssayanthus incanus Brasil M. S. Ferrucci 2710 --- Paullinia bracteosa --- P. Acevedo-Rodríguez 14908 --- Paullinia clavigera Brasil P. Acevedo-Rodríguez 14841 --- Paullinia elegans Brasil P. Acevedo-Rodríguez 11135 --- Serjania caracasana Guiana P. Acevedo-Rodríguez 3483 ---
Serjania communis Bogor Chase 2138 EU720472
Thinouia sp. México P. Acevedo-Rodríguez 12354 ---
Thouinia acuminata México A. Liston 633-2 EU720478
Thouinia portoricensis Porto Rico P. Acevedo-Rodríguez 11435 --- Thouinia trifoliata República
Dominicana
P. Acevedo-Rodríguez 14056 ---
Thouinia villosa México G. Hall 825 ---
Urvillea chacoensis Argentina A. H. Keller 6834 --- Urvillea rufescens Brasil Somner & Ferrucci, 1073 --- Urvillea ulmacea México P. Acevedo-Rodríguez 15145 ---
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