Optou-se por utilizar o algor´ıtimo de m´axima verossimilhan¸ca (Felsens- tein, 1981) [21] pela dificuldade de se utilizar um grupo externo para os Xenarthra, por conta da grande divergˆencia gen´etica entre estes e os marsu- piais, como discutido adiante. A filogenia foi obtida com o programa PAUP v4.0b10 (Swofford, 2003) [73], assim como os resultados dos testes G1 (Hil- lis, 1991) [32], para a verifica¸c˜ao do sinal filogen´etico. O modelo evolutivo utilizado foi calculado pelo crit´erio Akaike no programa Modeltest v3.7 (Po- sada & Crandal, 1998) [61]. As ´arvores geradas foram transformadas do formato texto de ´arvores nativo do ClustalW (.tree) para o formato texto do programa TreeGraph v1.0 (.tgf) e posteriormente para o formato gr´afico Encapsulated Post Script (.eps) com o programa TreeGraph M¨uller & M¨uller (2004) [46].
Tabela 5: Banco de dados 2 (gene 16S mais genes mitocondriais do banco de dados usado em Delsuc et al. [2003]).
T´axons 16S 12S ND1
Bradypus tridactylus EF405903* AF038022* AB011218* Choloepus didactylus EF405909* AJ278152* AJ505830* Myrmecophaga tridactyla EF405898* AJ278153* AJ505831* Tamandua tetradactyla EF405895* AJ278154* AB011216* Cyclopes didactylus DQ243711* AJ278155* AJ505832* Dasypus novemcinctus EF405889* Y11832* Y11832* Euphractus sexcinctus MPEG-22163** AJ505826* AJ505834* Chaetophractus villosus AF069534* U61080* AJ505835*
Zaedyus pichiy **** AJ505827* AJ505836*
Tolypeutes tricinctus MPEG-22026** AJ505828* AJ505837* Cabassous unicinctus Z48940* AJ278151* AB011217* Priodontes maximus MPEG-22688** AJ505829* AJ505838* * No
GenBank ** No
Museu Goeldi
Tabela 6: Banco de dados 2 (genes nucleares do banco de dados usado em Delsuc et al. [2003]).
T´axons VWF BRCA1 ADRA2
Bradypus tridactylus U31603* AF284002* AJ251179* Choloepus didactylus AJ278160* AF484229* AJ427375* Myrmecophaga tridactyla AJ278157* AF484232* AJ427373* Tamandua tetradactyla AJ278161* AF284001* AJ427374* Cyclopes didactylus AJ278156* AF484231* AJ315943* Dasypus novemcinctus AJ278158* AF484222* AJ427366* Euphractus sexcinctus AJ427364* AF484224* AJ427368* Chaetophractus villosus AF076480* AF284000* AJ315935* Zaedyus pichiy AJ427365* AF484226* AJ427369* Tolypeutes tricinctus AJ427362* AF484227* AJ427370* Cabassous unicinctus AJ278159* AF484228* AJ427371* Priodontes maximus AJ427363* AF484225* AJ427372* * No
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Resultados
O banco de dados montado com as seq¨uˆencias do gene mitocondrial rRNA 16S mostrou, atrav´es do teste G1 para 1.000.000 de ´arvores geradas aleato- riamente pelo crit´erio de parcimˆonia, uma alta significˆancia (g1 = 0.791, p < 0, 05), indicando um alto n´ıvel de estrutura gen´etica para o banco de dados (ver: Hillis & Huelsenbeck, 1992 [33] para uma avalia¸c˜ao da significˆancia de G1). Hillis & Huelsenbeck (1992) [33] observaram que `a medida que o sinal filogen´etico aumenta, a distribui¸c˜ao dos scores (n´umero de passos) de ´arvores de m´axima parcimˆonia geradas ao acaso se torna mais assim´etrica para a esquerda (Figura - 17). A estat´ıstica G1 mede o grau de assimetria da curva.
Para a an´alise de m´axima verossimilhan¸ca do banco de dados do gene 16S, o modelo evolutivo calculado pelo modeltest foi o geral revers´ıvel, assumindo uma distribui¸c˜ao gama (GTR+G). A freq¨uˆencia de bases foi igual a: A = 0.3245, C = 0.2454, G = 0.2078 e T = 0, 2223. A propor¸c˜ao de s´ıtios invari´aveis foi igual a zero (pinvar = 0). O parˆametro α da distribui¸c˜ao gama foi: Shape=0.2460.
A ´arvore de m´axima verossimilhan¸ca gerada pelo banco de dados do gene 16S obteve score = 2693.80482, com 1452 rearranjos testados em 12 min e 34 s. Como esta ´arvore n˜ao ´e enraizada, a monofilia das duas ordens de
Figura 16: Freq¨uˆencia de ´arvores mais parcimoniosas geradas ao acaso a partir do banco de dados do gene 16S.
Xenarthra (Cingulata e Pilosa) pode ser inferida pelo tamanho menor do ramo que separa Dasypus dos demais Cingulata, em rela¸c˜ao ao que separa Dasypus dos Pilosa, indicando a validade dessas duas ordens. Assim, Dasy- pus pode ser considerado como o mais basal entre todos os tatus. Os gˆeneros restantes s˜ao divididos em dois grupos que correspondem exatamente `as sub- fam´ılias Euphractinae (abrigando Euphractus e Chaetophractus) e Tolypeu- tinae (com Cabassous, Tolypeutes e Priodontes). Contudo, as rela¸c˜oes dentro deste ´ultimo grupo n˜ao puderam ser evidenciadas com valores significativos de bootstrap. A an´alise de m´axima verossimilhan¸ca com bootstrap para 1000 pseudo-r´eplicas foi feita em 20 h 39 min e 35 s.
´
gene 16S (Figura - 18) com os valores de bootstrap anotados em cada n´o (Figura - 19):
(Dasypus novemcinctus GB, (Dasypus septemcinctus MG, Dasy- pus kappleri MG)72, ((((( Bradypus tridactylus GB, Bradypus va- riegatus GB)90, Bradypus torquatus GB)98, Choloepus didactylus GB)98, ((Myrmecophaga tridactyla GB, Tamandua tetradactyla GB)94, Cyclopes didactylus GB)93)100, ((( Euphractus sexcinc- tus GB, Euphractus sexcinctus MG)98, Chaetophractus villosus GB)96, ((Priodontes maximus MG, Priodontes maximus PV)100, (Tolypeutes tricinctus MG, Cabassous unicinctus GB)59)52)56) 100).
Quando o banco de dados do gene 16S ´e concatenado ao banco de dados de Delsuc et al. (2003) [15], o grupo Cingulata aparece dividido em trˆes ramos, como na an´alise do gene 16S separadamente. A ´arvore mais prov´avel encontrada nesta an´alise apresenta um score = 31299.23208, com 525 rear- ranjos testados em 1 mim e 11 s. A an´alise de m´axima verossimilhan¸ca com bootstrap para 1000 pseudo-r´eplicas foi feita em 1 h 38 min.
´
Arvore de m´axima verossimilhan¸ca gerada a partir do banco de dados do gene 16S concatenado ao banco de dados de Delsuc et al. (2003) [15] (Figura
Dasypus novemcinctus GB Dasypus septemcinctus MG Dasypus kappleri MG Bradypus tridactylus GB Bradypus variegatus GB Bradypus torquatus GB Choloepus didactylus GB Myrmecophaga tridactyla GB Tamandua tetradactyla GB Cyclopes didactylus GB Euphractus sexcinctus GB Euphractus sexcinctus MG Chaetophractus villosus GB Priodontes maximus MG Priodontes maximus PV Tolypeutes tricinctus MG Cabassous unicinctus GB 0.1
Figura 17: Filogenia molecular dos Xenarthra com base no gene mitocondrial 16S obtida pelo crit´erio de m´axima verossimilhan¸ca. GB = GenBank; MG = Museu Goeldi; e PV = Porto Velho.
Dasypus novemcinctus GB 72 Dasypus septemcinctus MG Dasypus kappleri MG 100 100 98 98 90 Bradypus tridactylus GB Bradypus variegatus GB Bradypus torquatus GB Choloepus didactylus GB 93 94 Myrmecophaga tridactyla GB Tamandua tetradactyla GB Cyclopes didactylus GB 56 96 98 Euphractus sexcinctus GB Euphractus sexcinctus MG Chaetophractus villosus GB 52 100 Priodontes maximus MG Priodontes maximus PV 59 Tolypeutes tricinctus MG Cabassous unicinctus GB
Figura 18: ´Arvore de consenso de maioria da an´alise de m´axima verossimi- lhan¸ca com bootstrap de 1000 pseudo-r´eplicas, para a filogenia molecular dos Xenarthra, inferida a partir do banco de dados do gene 16S.
(Bradypus, (Choloepus, ((Cyclopes, (Myrmecophaga, Tamandua) 100)100, (Dasypus, (((Cabassous, Priodontes)68, Tolypeutes)100, ((Chaetophractus, Euphractus)65, Zaedyus)100)100)100)100)100).
Bradypus Choloepus Cyclopes Myrmecophaga Tamandua Dasypus Cabassous Priodontes Tolypeutes Chaetophractus Euphractus Zaedyus 0.1
Figura 19: Filogenia molecular dos Xenarthra obtida pelo crit´erio de m´axima verossimilhan¸ca, a partir dos bancos de dados concatenados 16S e banco de dados de Delsuc et al. (2003).
Bradypus 100 Choloepus 100 100 Cyclopes 100 Myrmecophaga Tamandua 100 Dasypus 100 100 68 Cabassous Priodontes Tolypeutes 100 65 Chaetophractus Euphractus Zaedyus
Figura 20: ´Arvore de consenso de maioria da an´alise de m´axima verossimi- lhan¸ca com bootstrap de 1000 pseudo-r´eplicas, para a filogenia molecular dos Xenarthra, inferida a partir do banco de dados do gene 16S e do banco de dados de Delsuc et al. (2003).
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Discuss˜ao
Ap´os a An´alise do Gene 16S Qual a Filogenia mais Confi´avel? Uma polariza¸c˜ao entre filogenias obtidas com dados morfol´ogicos e com dados moleculares parece se estabelecer no meio cient´ıfico atualmente. Isso parece o resultado de avan¸cos t´ecnicos que tornam as an´alises morfol´ogicas e moleculares cada vez mais heterogˆeneas, dificultando a compara¸c˜ao de to- pologias obtidas de dados de naturezas diferentes. Diversos testes para a compara¸c˜ao de ´arvores est˜ao dispon´ıveis na Literatura (ver: Schneider [2003] [66] para uma breve discuss˜ao). No entanto, a mera utiliza¸c˜ao de um des- tes testes para comparar ´arvores de naturezas diferentes n˜ao garante que a ´arvore escolhida seja a verdadeira.
As an´alises morfol´ogicas geralmente contemplam um maior n´umero de t´axons, devido `a facilidade de acesso aos mesmos em cole¸c˜oes de museus. Por outro lado, an´alises moleculares apresentam um maior n´umero de caracteres, advindos da facilidade de se seq¨uenciar regi˜oes cada vez maiores dos genomas. Que aspecto seria o mais importante para a acur´acia de uma filogenia? A topologia correta de uma ´arvore certamente ser´a aquela apoiada pelo maior n´umero de caracteres. Contudo, uma an´alise s´o pode ser considerada quando contempla todos os t´axons do grupo ou uma parcela significativa destes.
lares ap´oiam topologias diferentes. O trabalho de Gaudin & Wible (2005) [26] sintetizou a informa¸c˜ao morfol´ogica dispon´ıvel para os Cingulata englo- bando os dados apresentados por Engelmann (1985) [19], Patterson et al., 1989 [56], Carlini & Scillato-Yan (1996) [7]. Cento e sessenta e seis carac- teres da morfologia crˆanio-dental foram analisados para os oito gˆeneros com representantes vivos e mais onze gˆeneros extintos. Delsuc et al. (2003) [15] sintetizaram toda a informa¸c˜ao molecular dispon´ıvel para elucidar a filogenia dos Cingulata. Foram analisados 6968 caracteres dos genomas mitocondrial e nuclear de doze dos treze gˆeneros de tatus atuais. O presente trabalho acrescenta mais 592 caracteres, gerados a partir do seq¨uenciamento do gene mitocondrial rRNA 16S, ao banco de dados de Delsuc et al. (2003) [15].
A topologia gerada com a an´alise do gene 16S corrobora a topologia apresentada por Delsuc et al. (2003) [15]. Por´em, o gene 16S n˜ao apresenta suporte estat´ıstico satisfat´orio para os ramos que definem a rela¸c˜ao entre os gˆeneros dentro da sub-fam´ılia Tolypeutinae: ((Priodontes maximus MG, Priodontes maximus PV)100, (Tolypeutes tricinctus MG, Cabassous unicinc- tus GB)59)52)56). Assim como o gene 16S, os marcadores utilizados por Delsuc et al. (2003) [15], tamb´em n˜ao d˜ao suporte estat´ıstico para todos os n´os da ´arvore dos Cingulata.
Quando os genes s˜ao concatenados, as sub-fam´ılias Dasypodinae e Toly- peutinae apresentam suporte estat´ıstico de bootstrap, mas a rela¸c˜ao entre
os gˆeneros dentro das sub-fam´ılias permanece incerta: (Dasypus, (((Cabas- sous, Priodontes)68, Tolypeutes)100, ((Chaetophractus, Euphractus)65, Za- edyus)100)100)100)100)100). Uma melhora nos valores de bootstrap nos ramos dentro das sub-fam´ılias ´e percebida em rela¸c˜ao ao trabalho de Delsuc et al. (2003) [15].
Quais as Causas da Falta de Suporte Estat´ıstico em Alguns N´os? Eventos de especia¸c˜ao r´apida (especia¸c˜ao explosiva), como afirmam Del- suc et al. (2003) [15], devem realmente ter ocorrido dentro das sub-fam´ılias de tatus, impedindo que muta¸c˜oes autapom´orficas, para estes grupos, se fixassem nos marcadores utilizados. Como resultado, as an´alises para este grupo n˜ao apresentam suporte estat´ıstico para todos os n´os dentro da ´arvore, mesmo com um grande n´umero de caracteres utilizados. Situa¸c˜ao semelhante ocorreu durante a resolu¸c˜ao das rela¸c˜ao entre o gorila, o chimpanz´e e o ho- mem. Como a evolu¸c˜ao deste grupo tamb´em ocorreu de maneira r´apida s´o ap´os o seq¨uenciamento de uma quantidade muito grande de dados ´e que se pˆode resolver a rela¸c˜ao do grupo.
Que Marcadores S˜ao os mais Adequados para Resolver a Falta de Suporte Estat´ıstico para a ´Arvore dos Cingulata?
No caso dos Cingulata, a busca por caracteres autapom´orficos, que re- solveriam as rela¸c˜oes dentro das sub-fam´ılias de tatus, deve ser feita em
dade de dados. Alternativamente, Elementos de Transposi¸c˜ao (TEs) tamb´em poderiam ser utilizados, pois tais marcadores, tidos como “Dollosos”, fixam autapomorfias. Marcadores Dollosos s˜ao aqueles utiliz´aveis em uma an´alise de Parcimˆonia de Dollo e s˜ao gerados a partir de eventos raros.
O m´etodo de Parcimˆonia de Dollo foi primeiro sugerido por Le Quesne (1974) [39] e posteriormente melhor especificado por Farris (1977) [20]. O algor´ıtimo utilizado nesta an´alise assume a presen¸ca de um car´ater no estado 0 que permite uma ´unica mudan¸ca 0 => 1 (para a frente). Isto ´e poss´ıvel quando ´e pequena a probabilidade de mudan¸ca 0 => 1 no tempo evolutivo envolvido, gerando uma probabilidade da mudan¸ca 1 => 0 (reversa) muito menor. Portanto, o algor´ıtimo minimiza o n´umero de revers˜oes necess´arias para explicar os dados.
Os TEs (Elementos de Transposi¸c˜ao) s˜ao eventos raros de recombina¸c˜ao do genoma nuclear. Recombina¸c˜ao nem sempre depende de regi˜oes cro- mossˆomicas hom´ologas ou da prote´ına RecA presente em organismos proca- riotos, apesar destes serem os mecanismos mais freq¨uentes. Existem outros tipos de recombina¸c˜ao, que geralmente dependem de enzimas que reconhe- cem seq¨uˆencias de DNA. Os Elementos de Transposi¸c˜ao, ou transposons, s˜ao seq¨uˆencias de DNA que podem se transferir de uma regi˜ao para outra do genoma, deixando ou n˜ao uma c´opia no local onde estavam. A transposi¸c˜ao pode ser para o mesmo cromossomo ou para um cromossomo diferente Lie-
bert et al. (1999) [40].
Alguns transposons s˜ao bastante gen´ericos na sua escolha de alvo, e po- dem se transpor de forma quase aleat´oria dentro de um genoma. Em con- traste, existem outros que tˆem locais altamente favorecidos para onde o trans- poson pode ir, e alguns com regi˜oes de DNA preferenciais. De fato, quando um evento de transposi¸c˜ao raro acontece, ele se perpetua, sendo transferido em uma ´unica via (0 => 1) dos ancestrais aos descendentes. Isto quer di- zer, que se dois t´axons compartilham um TE espec´ıfico ´e porque o ancestral destes t´axons tamb´em o compartilhava. Segundo Shedlock & Okada, (2000) [67], Murphy et al. (2004) [48], Springer et al. (2004) [72], Bashir et al. (2005) [5], Kriegs et al. (2006) [38], Nishihara et al. (2006) [50] e Rokas & Carroll (2006) [63] Elementos de Transposi¸c˜ao tˆem um alto potencial para a resolu¸c˜ao de n´os dif´ıceis dentro de uma filogenia.
Existe uma grande quantidade de elementos de transposi¸c˜ao nos eucario- tos, alguns s˜ao funcionais e outros apresentam-se como restos de seq¨uˆencias n˜ao funcionais. Algumas esp´ecies, tais como o milho, tˆem mais de 50% de seu genoma como seq¨uˆencias de Elementos de Transposi¸c˜ao. Acredita-se que no homem este n´umero seja de 40%, constitu´ıdos por seq¨uˆencias LINEs e Alu, que s˜ao tipos de Elementos de Transposi¸c˜ao espec´ıficos Liebert et al. (1999) [40]. Os primeiros LINEs ou Elementos de Inser¸c˜ao Nuclear Longos para
por Waters et al. (2004) [77].
Kriegs et al. (2006) [38] foram os primeiros a utilizar estes Elementos de Transposi¸c˜ao para analisar a hist´oria evolutiva dos mam´ıferos placent´arios, chegando `a conclus˜ao que os Xenarthra s˜ao grupo irm˜ao de todos os outros mam´ıferos eut´erios e apresentando os marsupiais como seu grupo externo. Murphy et al. (2007) [49] contestaram estes resultados. Utilizando uma grande quantidade de dados de inser¸c˜oes/dele¸c˜oes, Murphy et al. (2007) [49] n˜ao verificaram esta posi¸c˜ao basal para os Xenarthra dentro da ´arvore dos mam´ıferos eut´erios. Apesar destes resultados opostos, os dados de Kri- egs et al. (2006) [38] s˜ao mais confi´aveis, por conta do car´ater Dolloso dos Elementos de Transposi¸c˜ao.
Considerando os Resultados de Kriegs et al. (2006), Quais os Efeitos da Adi¸c˜ao de Seq¨uˆencias de Marsupiais, como Grupo Ex- terno, ao Banco de Dados dos Xenarthra?
Didelphis virginiana, um marsupial de ocorrˆencia norte americana, apre- senta seu genoma mitocondrial completamente seq¨uenciado e existem tamb´em seq¨uˆencias do gene BRCA1 dispon´ıveis no GenBank. Portanto, este mar- supial apresenta quatro genes, dos seis utilizados neste trabalho, seq¨uenciados e dispon´ıveis na internet. An´alises do banco de dados do gene 16S e do banco de dados dos genes mitocondriais 12S e ND1, mais o 16S utilizando-se Di- delphis virginiana como grupo externo foram realizadas, mas n˜ao foram apre-
sentadas neste trabalho. Mesmo com a confirma¸c˜ao ou poss´ıvel confirma¸c˜ao, de Kriegs et al. (2006) [38], da posi¸c˜ao basal dos Xenarthra dentro da ´arvore evolutiva dos eut´erios, a ausˆencia destes dados no trabalho, ´e justificada pela falta de estabilidade da an´alise, em decorrˆencia da grande divergˆencia gen´etica entre marsupiais e xenartros.
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Conclus˜ao
A an´alise do gene mitocondrial rRNA 16S corroborou os resultados de Delsuc et al (2003) [15], aumentou a acur´acia dos padr˜oes de filogenia para o grupo Xenarthra, confirmou a monofilia das sub-fam´ılias Dasypodinae, Tolypeutinae e Euphractinae da fam´ılia Dasypodidae. No entanto, n˜ao con- seguimos estabelecer rela¸c˜oes estatisticamente consistentes entre os gˆeneros. Analisando-se as ferramentas dispon´ıveis, sugerimos a utiliza¸c˜ao de Elemen- tos de Tranposi¸c˜ao do tipo LINEs para a investiga¸c˜ao do grupo Cingulata com uma resolu¸c˜ao estatisticamente significativa em n´ıvel de gˆenero.
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