5. DISCUSSÃO
5.4. Alterações de espessura dos tecidos peri-implantares
5.7.3. Alterações de espessura e volume em função das classes de BPD T0
4.1. Caractérisation de la lignée de cellules OK (opossum
kidnev)
La lignée de cellules OK a été établie au départ de tissu rénal d’un opossum
adulte d’Amérique {Didelphys virginiana). Cette lignée prolifère rapidement et est
stable du point de vue morphologique et de son caryotype [Koyama H. et al., 1978].
Les cellules OK s’organisent en monocouches de cellules épithéliales polarisées et
partagent de nombreuses propriétés morphologiques et fonctionnelles avec les
cellules tubulaires proximales [Malstrom K. et al., 1987].
Propriétés de transport
La membrane apicale des cellules OK comporte les systèmes de transport
couplés au Na* pour les acides aminés, le glucose, les protons et le phosphate
inorganique ainsi qu’une sensibilité hormonale à la PTH et à la calcitonine
[Malmstrom K. et al., 1986; Malstrom K. et al., 1987] (Tableau 6). La lignée rénale de
cellules OK est la seule lignée cellulaire établie avec des caractéristiques proximales
ayant la capacité de réguler le co-transport Na*dépendant/phosphate en réponse,
soit à un agent rapide comme la PTH [Hruska K.A. et al., 1987; Teitelbaum A.P. et
al., 1984; Teitelbaum A.P. et al., 1986], soit un stimulus prolongé comme une
déprivation chronique en phosphate organique ou l’exposition à de l’hormone
thyroïdienne [Quamme G. et al., 1989; Yonemura K. et al., 1990]. En effet, les
récepteurs de haute affinité pour la PTH, présents dans les cellules OK, sont couplés
à l’activation de l’adénylate cyclase et l’inhibition du co-transport NaVphosphate
[Caverzasio J. et al., 1986; Cole J.A. et al., 1987; Malmstrom K. et al., 1986;
Teitelbaum A.P. étal., 1986].
Tableau 6 : Caractéristiques des transports tubulaires au niveau de l’épithélium proximal des cellules OK
Transporteur Sodium Localisation Substrat Activateur Inhibiteur Régulateur Références
NaVacides aminés
dépendant apicale
Acides aminés acides : L-
glutamate
Acides aminés neutres :
L-proline, L-alanine, L-
phénylalanine
[Malstrom K. et al.,
1987; Schwegler J.S. et
al., 1989b]
indépendant basolatérale
Acides aminés neutres :
L-alanine
Acides aminés
dibasiques : L-arginine
Na^/hexoses
NaVglucose
dépendant apicale a-méthyl-D-glucoside
D-glucose Phlorizine
[Malstrom K. et al.,
1987; Van den B.L et
al., 1989]
indépendant basolatérale D-glucose Cytochalasine B
Na^/phosphate dépendant PTH PTH
[Caverzasio J. et al.,
1986; Malmstrom K. et
al., 1986; Teitelbaum
A.P. étal., 1984]
Na"^/phosphate
inorganique
NaPi type lia
dépendant apicale Hormonale,
PTH
[Cole J.A. et al., 1987;
Malstrom K. et al., 1987]
NaVsulfate
inorganique indépendant
[Malstrom K. et al.,
1987]
Échangeur Na*/H*
NHE3 apicale Insuline PTH amiloride
[Gekie M. et al., 1999;
Helmle-Kolb C. et al.,
1990; Klisic J. et al.,
2002; Malstrom K. et al.,
1987; Pollock A.S. et al.,
1986]
Echangeur
HVcations
organiques
Echangeur cations
organiques/cations
organiques
apicale T etraéthylammonium
Cations organiques
(1mM): N^-
méthylnicotine amide,
amiloride, cimetidine,
verapamil,
procainamide,
quinidine
[McKinney T.D. et al.,
1990; Yuan G. et al.,
1991]
Echangeur
PAH/anions
organiques
Echangeur PAH
(anions
organiques)/dicarb
oxylates
apicale Para-aminohippurate
(PAH)
Probénécide,
furosémide, diéthyl
pyrocarbonate
(inhibiteur du transport
d’anions organiques
sensibles au potentiel),
dicarboxylates
PTH (par la
voie de la
protéine
kinase C)
[Habu Y. et al., 2002;
Nagai J. et al., 1997;
Takano M. et al., 1994]
Echangeur PAH
(anions
organiques)/dicarb
oxyiates
dépendant basolatérale PAH
Dicarboxylates
(a-kétoglutarate),
probénécide,
furosémide,
antibitiques P-lactames
(benzylpénicilline,
céfazoline)
EGF
[Hori R. et al., 1993;
Nagai J. et al., 1995;
Sauvant C. et al., 2001;
Takano M. et al., 1994]
Les cellules OK contiennent également des transports spécifiques des anions
et des cations organiques [Hori R. et al., 1993; Yuan G. et al., 1991].
Dans les cellules OK, la distribution des transporteurs d’hexoses dépendant et
indépendant du sodium ainsi que l’existence à la membrane apicale de systèmes de
transport couplé au sodium pour le glutamate (dépendant du interne), la L-proline
et la L-alanine, le phosphate inorganique et l’échangeur NaYH"" sont en accord avec
les données caractérisant le transport tubulaire proximal [Malstrom K. et al., 1987].
Réponse hormonale
La PTH inhibe l’activité du co-transporteur Na/Pi de type Ha (NaPi-4), exprimé
à la surface apicale des cellules OK [Sorribas V. et al., 1994]; la diminution associée
à l’expression de la protéine du co-transporteur Na/Pj de type Ha à la membrane
apicale entraîne une accumulation subapicale transitoire du transporteur et sa
dégradation lysosomale [Keusch I. et al., 1998; Malmstrom K. et al., 1987; Pfister
M.F. et al., 1997; Pfister M.F. et al., 1998]. La première étape de la régulation par la
PTH est l’internalisation de la protéine du co-transporteur Na/Pj de type Ha au départ
de la membrane apicale conduisant à sa dégradation lysosomale [Jankowski M. et
al., 1999].
L’insuline stimule l’activité de l’échangeur NaVH^ NHE3. Dans les cellules OK,
l’insuline augmente l’activité de l’échange NaYH* de manière dépendante du temps
et de la concentration ; cet effet est dû à l’activation de NHE3. L’insuline semble
stimuler l’activité de NHE3 tubulaire rénal par un mécanisme biphasique impliquant
des facteurs post-transcriptionnels et une augmentation de l’expression du gène de
NHE3 ; ces effets sont amplifiés sous l’action de l’hydrocortisone [Klisic J. et al.,
2002].
Les cellules OK sont également sensibles à d’autres hormones : le facteur
atrial natriurétique [Nakai M. et al., 1988], la calcitonine [Malmstrom K. et al., 1986],
la dexaméthasone [Rizzoli R. et al., 1987], la dopamine [Cheng L. et al., 1990],
l’épinéphrine [Murphy T.J. et al., 1988], le facteur de croissance 1 analogue à
l’insuline (IGF1) [Caverzasio J. et al., 1989], la prostaglandine E2 [Malmstrom K. et
al., 1986], la sérotonine [Murphy T.J. et al., 1989], l’hormone thyroïdienne [Yonemura
K. et al., 1990] et la vitamine D [Binswanger U. et al., 1993; Wald H. et al., 1998].
Propriétés électriques
Le potentiel de membrane des cellules OK est principalement (70%)
déterminé par la conductance des ions qui est bloquée par le baryum. La
dépolarisation des cellules OK est rapide en réponse à l’acidité intracellulaire,
complètement réversible et peut être protégée par l’amiloride. La perméabilité au K*
est donc régulée par le pH intracellulaire. La présence de l’échangeur NaYH^ permet
de compenser la charge acide intracellulaire induisant une repolarisation de la
membrane cellulaire par modification de la conductance K"". La pompe
électrogénique NaYK'^-ATPase contribue également à la conductance totale de la
membrane cellulaire (mais à 30%) [Schwegler J.S. et al., 1989a].
La résistance transépithéliale est extrêmement faible dans les monocouches
de cellules OK. Les cellules OK forment un grand nombre de dômes reflétant un
transport de soluté du côté apical vers le côté basolatéral. La réponse très rapide aux
changements de concentration ionique suggère que la conductance K"^ est localisée
à la membrane apicale des cellules. Les monocouches de cellules OK sont
électriquement faibles [Schwegler J.S. et al., 1989a].
Propriétés biochimiques
La croissance des cellules OK n’étant que légèrement diminuée dans un
milieu défini sans sérum par rapport à un milieu contenant du sérum, les
observations suivantes ont été réalisées pour des cellules OK en milieu sans sérum.
L’activité de la glutathion-S-transférase, un marqueur enzymatique spécifique du
cytosol des tubules proximaux est faible et le contenu total en glutathion diminue au
cours du temps. L’activité spécifique des enzymes marqueurs de la bordure en
brosse comme l’alanine aminopeptidase et la phosphatase alcaline est très faible ;
l’activité de la y-glutamyl transpeptidase est absente. En effet, les cellules OK
présentent une très faible quantité de microvillosités. L’activité de l’enzyme
lysosomale NAG est bien présente dans les cellules OK. L’activité de la succinate
déshydrogénase, une enzyme associée aux mitochondries, est constante. L’activité
de la NaVK^-ATPase est stable. L’activité de la lactate déshydrogénase et de
l’hexokinase, enzyme de la glycolyse, restent stables. Les cellules OK expriment une
très faible activité phosphoénoipyruvate carboxykinase [Courjault F. et al., 1991].
4.2. Endocytose médiée par récepteur
Les cellules OK ont la capacité de réabsorber les protéines par un mécanisme
d’endocytose bien distinct de l’endocytose en phase fluide [Schwegler J.S. et al.,
1991]. En effet, les monocouches de cellules OK réabsorbent l’albumine marquée à
la fluorescéine isothiocyanate (FITC) selon une cinétique de saturation dépendante
du temps et de la concentration, contrairement à l’inuline-FITC qui entre dans les
cellules par un processus non-saturable (Fig. 18). Le système de transport de
l’albumine dans les cellules OK possède une affinité apparente de 24 mg/l (20-30
mg/l), laquelle correspond à la concentration physiologique estimée dans la lumière
tubulaire (30mg/l [Eisenbach G.M. et al., 1975]). L’endocytose d’albumine-FITC
atteint son maximum à un pH extracellulaire de 7,4 mais est réduite en milieu acide
ou alcalin. Par contre, la concentration extracellulaire de sodium, de chlore ou de
calcium n’influence pas l’absorption d’albumine-FITC. Les cellules OK représentent
un modèle bien adapté pour étudier la réabsorption tubulaire proximale des
protéines.
L’albumine-FITC est un marqueur fiable pour suivre l’endocytose médiée par
récepteur : seulement environ 2 % de son endocytose est attribuée à l’endocytose en
phase fluide. L’albumine capturée par les cellules OK est dégradée en fonction du
pH vésiculaire. L’acidification des endosomes est particulièrement importante dans
l’endocytose médiée par récepteur de l’albumine. Par contre, la formation de
vésicules d’endocytose en phase fluide n’est pas influencée par l’alcalinisation des
endosomes ni par l’acidification du cytoplasme. Les cellules OK constituent
également un bon modèle pour étudier le pH endosomal [Gekie M. et al., 1995a]
La cinétique de l’endocytose d’albumine-FITC par les cellules OK est
influencée par le Ca^* et l’AMP cyclique mais pas au niveau de la formation des
vésicules d’endocytose, contrairement à l’endocytose en phase fluide du
FITC-dextran qui n’est pas modifiée. Le Ca^* est nécessaire à l’endocytose médiée par
récepteur mais n’intervient probablement pas dans sa régulation. Par contre, l’AMP
cyclique peut influencer l’endocytose médiée par récepteur dans des conditions
physiologiques [Gekie M. étal., 1995b].
lime (min)
Figure 18. Cinétiques de l’absorption d’albumine-FITC et d’inuline-FITC. A. Evolution au
cours du temps de la fluorescence intracellulaire après incubation avec 0,5 g/1 d’albumine à
37°C en milieu bicarbonate (cercle) et sur glace en solution Ringer (triangle). FITC-inuline ;
0,5g/l, 37°C en milieu bicarbonate (cercle noir). B. Taux d’absorption initial (15 min)
d’albumine-FITC (cercle) et d’inuline-FITC (cercle noir) à différentes concentrations du
substrat (37°C, milieu bicarbonate), n = 4-6. [Schwegler J.S. et al., 1991].
Les cellules OK expriment un site de liaison de haute affinité pour l’albumine à
la membrane apicale ; ce site de liaison est sensible au pH et lie l’albumine en
quantité physiologique [Gekie M. et al., 1996].
L’endocytose d’albumine par les cellules OK se déroule par la voie
dépendante de la clathrine et dépend essentiellement de l’intégrité du cytosquelette
d’actine. Les microtubules facilitent l’absorption par endocytose. La voie
d’endocytose médiée par les cavéoles, vésicules recouvertes d’un manteau de
cavéoline, n’est pas impliquée dans l’endocytose de l’albumine dans les cellules OK
[Gekie M. et al., 1997].
Enfin, l’endocytose d’albumine par les cellules OK implique les deux
récepteurs mégaline et cubiline intervenant dans l’endocytose médiée par récepteur.
Ces deux glycoprotéines sont co-exprimées et principalement co-localisées à la
I
surface des cellules (Fig. 19A). Des observations en microscopie électronique
montrent que la mégaline et la cubiline sont co-localisées à la surface des
microvillosités, dans les puits recouverts d’un manteau de clathrine et dans les
compartiments endocytaires (Fig. 19B). Seules les cellules exprimant la mégaline et
la cubiline sont capables d’absorber l’albumine, indiquant une association entre ces
deux récepteurs et l’endocytose d’albumine [Zhai X.Y. et al., 2000].
Figure 19. A. & B: Colocalisation (en jaune) par immunofluorescence de la mégaline (FITC,
en vert) et de la cubiline (TRIC, en rouge) dans les cellules OK (A x1100, B x1800).
C & D; Colocalisation (en jaune) par immunofluorescence d’albumine-FITC (en vert) et de la
cubiline (C) ou la mégaline (D) marquée au TRIC (en rouge). Grossissement x1400.
E. Double marquage immunocytochimique pour la mégaline et la cubiline observé en
microscopie électronique. La mégaline (particules d’or 5 nm) et la cubiline (particules d’or 10
nm) sont distribuées ensemble à la membrane apicale (flèche) et dans les vacuoles
d’endocytoses (tête de flèche) dans les cellules OK. MV: microvillosités. Grossissement
X86000. [Zhai X.Y. et al., 2000].
5. Toxicité tubuiaire des acides aristolochiques
Acides aristolochiques
Les acides aristolochiques (AA) sont extraits de plantes de la famille des
Aristolochia (par exemple Aristolochia clematitis, Aristolochia fangchi et Aristolochia
Manshurensis) et consistent en un mélange de composés structurellement dérivés
des acides carboxyliques nitrophénantrénes, principalement l’acide aristolochique I
(AAI) et l’acide aristolochique II (AAH) (Figure 20) [Mix D.B. et al., 1982].
Figure 20. Structure chimique de l’acide aristolochique I (AAI), acide 8-méthoxy-6-nitro-
phénantro-(3,4,d)-1,3-dioxolo-5-carboxylique et de l’acide aristolochique II (AAII), acide 6-
nitro-phénantro-(3,4,d)-1,3-dioxolo-5-carboxylique [Artt V.M. et al., 2002].
Métabolisme
Les études du métabolisme des AA dans différentes espèces dont l’être
humain montrent que les aristolactames produits par nitroréduction sont les
principaux métabolites retrouvés dans les urines et les fèces [Krumbiegel G. et al.,
1987]. L’aristolactame la, le principal métabolite d’AAl, est produit par deux voies
métaboliques, l’une par l’aristolactame I et l’autre par AAla (Fig. 21).
Formation d’adduits d’ADN
La transformation des aristolactames en agents aux propriétés mutagènes
résulte de l’activation métabolique des AA ; cette activation comporte une étape
cruciale, la nitroréduction [Schmeiser H.H. et al., 1984]. En effet, un ion N-
acylnitrenium cyclique porteur d’une charge positive délocalisée est produit ; il se lie
.COOH COOH .COOH
aristoHc acid I species: rat, mouse,
guinea pig, rabbit
species: rat, mouse, guinea pig, rabbit, dog, man
3,4-meth)'lencdioxy>8>hydroxy< 3,4>methyleDedioxy>l 'phen- l>phenanthrenecarboxy)ic acid anthrenecarboxylic acid
species: rat, mouse, guinea pig species: rat, mouse, guinea pig, rabbit
species: rat, mouse, guinea pig, rabbit
species: rat, mouse, guinea pig, rabbit, dog, man
Figure 21. Métabolisme de l’acide aristolochique I et de l’acide aristolochique II chez
différentes espèces de mammifère, y compris l’homme [Krumbiegel G. et al., 1987].
préférentiellement aux groupes amino exocycliques des nucléotides des bases
puriques de l’ADN, formant les adduits d’ADN, ou est hydrolysé en 7-
hydroxyaristolactame correspondant (Fig. 22) [Arlt V.M. et al., 2002]. Les structures
des principaux adduits d’ADN ont été déterminées par spectroscopie : 7-
(déoxyadénosine-N®-yl)aristolactame 1 (dA-AAl), 7-(déoxguanosine-N^-
yl)aristolactame 1 (dG-AAl),
7-(déoxyadénosine-N®-yl)aristolactame il (dA-AAll) [Pfau
W. et al., 1990; Pfau W. et al., 1991]. La méthode la plus couramment utilisée pour
détecter les adduits d’ADN est le dosage très sensible du post-marquage au ^^P.
Cette méthode appliquée tant in vitro qu'in vivo est quasi spécifique [Stiborova M. et
al., 1998].
.COOH
pnximaie carclnogen
V y
A'-hydroxyarlttolactam
7-bydroxyaristolactam 1, (II)
arbtolochic acid i (AAI): R-OCH, arbtolochlc acid II (AAII): R-H
V y
artslolBCtam-iiltiiuniloD
aiistolactam I, II
dA-AAI, dA-AAll