Amplificação da amostra por PCR

Após ser definido o conjunto de sondas identificadoras a utilizar no Funchip, foi necessário ter em atenção a amostra que se vai utilizar para detectar a infecção. Ao utilizar sangue de um paciente para diagnosticar uma infecção por um fungo patogénico, é necessário ter em conta que a concentração de DNA do organismo infeccioso é muito

baixa em termos absolutos e relativamente à concentração de DNA humano. Deste modo, é necessário amplificar por PCR o material genético do fungo sem amplificar o do paciente.

Para maior simplicidade, tentou encontrar-se pares de primers que amplificassem simultaneamente as sequências dos genes de rRNA das espécies em estudo. Este estudo permitiu identificar 4 pares de primers que amplificam as sequências pertencentes a 18S, ITS1, ITS2 e 28S dos fungos Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces paradoxus e Schizosaccharomyces pombe.

Para desenhar os pares de primers essenciais à reacção de PCR, foi necessário, em primeiro lugar, saber quais os intervalos das sequências a amplificar. Estes correspondem às regiões do rDNA onde se localizam (os alvos para) as sondas seleccionadas anteriormente. De seguida, encontraram-se zonas adjacentes homólogas entre todas as 10 espécies de fungos e diferentes das do homem – recorrendo a alinhamentos múltiplos. Os primers de PCR foram seleccionados dentro dessas zonas recorrendo ao script primers3.pl.

Em relação a 18S e 28S (tamanho na ordem dos milhares de nucleótidos), apenas são amplificados intervalos mais pequenos (cerca de 200-300 nucl.). Estes intervalos foram determinados por um dos scripts que seleccionou as sondas, o compmultalign4.pl. As sequências de ITS1 e ITS2, são integralmente amplificadas, pois são relativamente pequenas.

Como foi referido anteriormente, as sondas desenhadas com base no gene 18S foram seleccionadas entre as posições 638 e 828 do alinhamento (Anexo 2). Pela observação das regiões adjacentes a esta secção foi possível encontrar as zonas conservadas 602-630 e 847-866. Nestas duas regiões, a sequência das 10 espécies fúngicas é igual enquanto que a do H. sapiens apresenta um e quatro nucleótidos diferentes, respectivamente (ver alinhamento da Figura 41). Recorrendo ao script primers3.pl, caracterizaram-se todos os possíveis primers de 15 nucleótidos pertencentes a estas zonas.

Figura 41 – Alinhamento das duas regiões, do gene 18S, adjacentes à zona onde foram seleccionadas as sondas, nas 10 espécies de fungos e em H. sapiens. O primer 5’ e o primer 3’ foram seleccionados na primeira e na segunda regiões, respectivamente (separadas por “...”).

Para seleccionar os primers, para amplificar a região do gene 28S com os alvos para as sondas desenhadas, seguiu-se o mesmo princípio que para o gene anterior. As zonas adjacentes consideradas foram 329-344 e 687-716 do alinhamento (Anexo 4). Embora a sequência da segunda zona seja igual no genoma dos fungos e do homem, a sequência da primeira zona apresenta grande variabilidade entre H. sapiens e as 10 espécies fúngicas, o que não permite a completa amplificação do DNA daquele.

A amplificação da totalidade do ITS1 é possível através de um primer 5’ seleccionado na região conservada 1839-1853 no término do gene 18S e de um primer 3’ determinado na região conservada 32-46 no início do gene 5.8S (Alinhamento no Anexo 3). Para a escolha dos primers necessários à amplificação do ITS2 foram tidas em conta as regiões conservadas 47–63 do 5.8S e 35–61 da parte inicial do 28S.

Os primers, de 15 nucleótidos, seleccionados para a amplificação por PCR de 18S, ITS1, ITS2 e 28S estão apresentados na Tabela 6, bem como a sua temperatura de fusão. Estão igualmente indicadas as extensões (em bp) dos quatro produtos de PCR previstos para cada espécie.

Tabela 6 – Primers seleccionados para a amplificação por PCR de ITS1, ITS2 e secções de 18S e 28S nas 10 espécies em simultâneo. Para cada espécie/gene é indicada a extensão (bp) do respectivo produto de PCR. Na sequência dos primers, os nucleótidos a negrito e sublinhado representam as posições não conservadas entre as espécies de fungos em estudo e H. sapiens.

18S ITS1 ITS2 28S

primer 5’ TTAAAGTTGTTGCAG _{(40 ºC)} GGTCATTTAGAGGAA _{(42 ºC)} CAGCGAAATGCGATA _{(44 ºC)} CATCTAAAGCTAAAT _{(38 ºC)} primer 3’ TCCTAGAAACCAACA _{(42 ºC)} CGTTCTTCATCGATG _{(44 ºC)} TGCTTAAGTTCAGCG _{(44 ºC)} TCCGTGTTTCAAGAC _{(44 ºC)}

A. fumigatus 246 295 321 340 C. albicans 233 249 305 342 C. glabrata 246 513 384 351 C. tropicalis 231 249 295 340 C. neoformans 247 232 342 366 S. bayanus 246 469 385 342 S. cerevisiae 246 472 387 342 S. mikatae 246 471 385 342 S. paradoxus 246 473 386 342 S. pombe 258 531 454 359

Os primers estão indicados na orientação 5’-3’.

A selecção de primers, foi realizada obedecendo a vários critérios. Por exemplo, após verificar que as suas sequências pertenciam a regiões adjacentes às de selecção das sondas, que eram conservadas nas 10 espécies de fungos e que eram parcialmente diferentes das de H. sapiens, foi necessário encontrar sequências de 15 nucleótidos com aproximadamente a mesma Tm. O primer 5’ do gene 28S foi o que mais se distanciou da média das temperaturas de fusão de todos os primers, com um valor de 38 ºC.

O programa primers3.pl determinou as extensões máximas das secções inversamente complementares dentro de todas as cadeias dos primers, não se inferindo qualquer possibilidade de formarem estrutura secundária. A maior probabilidade de auto- hibridação ocorre no primer 3’ do ITS2, entre as secções GCT (posições 2-4) e AGC (12- 14). Por último, não se identificou um grau de complementaridade significativo entre os vários primers seleccionados. Os máximos observados entre dois primers é de apenas 6 nucleótidos complementares (por exemplo, entre ATTTAG do primer 5’ de ITS1 e CTAAAT do primer 5’ de 28S).

A sequência do primer 3’ de 28S, como foi referido, não apresenta nenhum nucleótido diferente em relação à sequência homóloga de H. sapiens. Este facto poderá afectar o rendimento da amplificação das sequências de DNA deste gene nos fungos, por competição com o DNA do homem. Uma alternativa seria utilizar o primer 5’-

nucleótidos de diferença (a negrito e sublinhado). No entanto, com este primer os respectivos produtos de PCR sofreriam um incremento de aproximadamente 180 bp.

Observa-se alguma diversidade a nível da extensão dos produtos de PCR, com um mínimo de 231 bp no gene 18S de C. tropicalis e um máximo de 531 bp no ITS1 de S. pombe. Estes valores introduzem algum bias no rendimento das várias reacções de amplificação e possivelmente uma diferenciação dos constrangimentos espaciais aquando da hibridação com as sondas do chip. Porém, não é esperado que ocorram alterações significativas dos resultados finais, dado que a ordem de grandeza de todos os produtos de PCR é semelhante.