AMPs utilizados no presente estudo

Os AMPs destacam-se como agentes promissores devido a algumas características que eles apresentam, como o seu tamanho geralmente pequeno, o seu amplo espetro de ação e a sua baixa toxicidade. No ponto seguinte serão descritos de forma mais detalhada os AMPs utilizados neste trabalho. No entanto, é de referir que, além do seu potencial, os AMPs podem apresentar algumas desvantagens, que apesar de poderem ser ultrapassadas devem ser referidas. Entre essas desvantagens destacam-se o elevado custo que poderá estar envolvido no processo de síntese e produção dos AMPs e o facto de os AMPs poderem ser suscetíveis à proteólise, podendo originar resistências [51, 52, 58, 64].

1.7.1 Cecropina-B

A cecropina-B é um AMP catiónico natural que é encontrado na pupa Hyalophora cecropia. À semelhança dos AMPs de insetos a cecropina-B desempenha um papel importante na defesa humoral, sendo em caso de infeção, sintetizada no corpo gordo e, posteriormente, secretada na hemolinfa.

A cecropina-B é um péptido linear com uma estrutura α-helicoidal e não possuiu resíduos de Cys. É um pequeno AMP com apenas 35-39 resíduos de aminoácidos [52].

A atividade antimicrobiana da cecropina-B está estritamente relacionada com a capacidade de formar α-hélices anfipáticas. Assim, quando em contacto com a superfície da bicamada lipídica das células, carregada negativamente, a região polar da cecropina-B, carregada positivamente, rica em resíduos de lisina, facilita a atração eletrostática inicial para os fosfolípidos, carregados negativamente, das células alvo. Desta forma, a cecropina-B irá provocar modificações na estrutura da membrana conduzindo à rutura e libertação do conteúdo celular [52, 66].

A cecropina-B é, assim, um AMP essencial para a resposta imune inata, sendo eficaz na eliminação de patogénicos. Além disso, pode também promover a regeneração de feridas e apresenta um amplo espetro de atividade contra bactérias gram-positivas e gram-negativas, fungos, parasitas e vírus [52, 66].

1.7.2 [Ala5]-Tritrp7

O [Ala5]-Tritrp7 é um péptido análogo sintético da Tritrpticina que pertence à família das catelicidinas (CAMPs). Este péptido catiónico pequeno resulta da substituição da primeira prolina (Pro), situada na posição cinco da Tritrpticina, por um resíduo de alanina (Ala) (tritrp7). Esta substituição foi estudada para investigar o papel desempenhado por estes resíduos, em específico, nas propriedades estruturais e atividade biológica do péptido nativo [67].

Esta substituição resultou num péptido com maior tendência a adotar uma conformação helicoidal anfipática. Esta conformação facilita a interação do péptido com as membranas microbianas, pois os resíduos polares encontram-se organizados no lado da hélice oposto aos resíduos apolares. Existe, assim, uma melhor organização, permitindo ao péptido ser eletrostaticamente atraído para as membradas bacterianas carregadas negativamente, o que consequentemente melhora a atividade antimicrobiana [67].

O [Ala5]-Tritrp7 é assim um AMP sintético promissor devido às notórias melhorias provocadas na atividade antimicrobiana, pela substituição específica na sequência de

aminoácidos da Tritrpticina. Além disso, exibe atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas [67].

1.7.3 Cys-LC-LL-37

Os AMPs da família das catelicidinas (CAMPs) são os principais componentes da imunidade inata e atuam diretamente contra infeções microbianas. A família das CAMPs é altamente heterogénea e abrange uma vasta gama de péptidos que variam em comprimento e que apresentam sequências com pouca similaridade e uma marcada diversidade estrutural [68].

As CAMP são caracterizadas por apresentarem uma pró região N-terminal dotada de nenhuma atividade biológica e um C-terminal de grande heterogeneidade que codifica o péptido maduro. Desta forma, as CAMPs são sintetizadas como precursores com um pró- domínio N-terminal grande (94-114 aminoácido) e altamente conservado, conhecido como domínio Cathelin ou CLD. Durante o processo de ativação, uma enzima específica remove esse domínio (CLD) e liberta o AMP do C-terminal para exibir a sua função de CAMP [68].

No entanto, apesar dos mamíferos possuírem uma grande diversidade de CAMPs, nos humanos é apenas encontrada uma. A CAMP humana é armazenada como uma pró-forma de 16 KDa, ou seja, como uma pró-catelicidina, nos grânulos secundários dos neutrófilos. A pró- catelicidina é também conhecida como CAP18 humana (hCAP18) e consiste de um CLD N- terminal (hCLD) de 103 resíduos de aminoácidos e de um péptido catelicidina C-terminal, LL- 37, de 37 resíduos. Assim, após estimulação, a pró-catelicidina é transformada pela proteinase 3, uma serina-protease proveniente de grânulos azurófilos, em hCLD e no AMP funcional LL-37 [68].

De facto, o LL-37 é um péptido especial, pois apesar de ser sintetizado em humanos e de ser principalmente expresso nos neutrófilos, pode também encontrar-se em outros locais diferentes. Nomeadamente em células sanguíneas, incluindo monócitos e linfócitos, em determinadas células epiteliais escamosas das vias respiratórias, no intestino, vagina, epidídimo, testículo e ainda em queratinócitos em doenças inflamatórias da pele [68].

O LL-37 foi, inicialmente, reconhecido pelo seu amplo espetro de atividade antimicrobiana contra bactérias, fungos e patogénicos virais e por exibir uma estrutura α- helicoidal anfipática após ligação à membrana alvo. A organização do péptido nessa estrutura promove a incorporação e a alteração da membrana celular e leva, consequentemente, à libertação do conteúdo celular e à morte da célula [68].

Porém, outras funções biologicamente importantes do péptido humano LL-37 foram posteriormente descobertas. Essas funções adicionais incluem propriedades

imunomoduladoras e quimioestáticas, a estimulação da angiogénese e atividades neutralizantes do LPS.

Desta forma, o amplo espetro de atividade do LL-37, aliado ao facto deste péptido adotar uma estrutura em α-hélices anfipática que facilita a interação com os fosfolípidos aniónicos das células bacterianas alvo, levou a que um péptido sintético fosse desenvolvido com o intuito de aliar o seu importante papel antimicrobiano ao também conhecido efeito antimicrobiano da Cys. Assim, o AMP Cys-LC-LL-37 resultou da adição do resíduo de Cys ao péptido natural LL-37. Esta adição foi conseguida através da utilização de um ligante de seis carbonos (LC) [47, 68, 69].

Assim, a modificação da extremidade de um terminal do péptido LL-37, por adição da Cys, que possui na cadeia lateral grupos –SH livres com capacidade de reagir com os grupos - SH das proteínas presentes na membrana microbiana, teve como intuito melhorar a eficácia antimicrobiana [46].

De facto, este péptido desempenha um papel importante no aumento da atividade antimicrobiana, pois tem a vantagem acrescida de reunir o péptido natural LL-37 e a Cys, cujo efeito antimicrobiano já foi anteriormente comprovado.

Capítulo 2

Objetivos

O principal objetivo deste trabalho consistiu em investigar o potencial de compostos naturais a serem usados como agentes eficazes no tratamento antimicrobiano de materiais têxteis. Estes agentes visam satisfazer a permanente necessidade de se obterem soluções ecológicas e não tóxicas. Para isso irá recorrer-se à utilização de substâncias de natureza peptídica, AMPs, que são defesas naturais de todos os organismos vivos.

A incorporação dos AMPs em materiais têxteis irá permitir avaliar o seu potencial enquanto substâncias eficazes, duráveis e não tóxicas e, principalmente, com reduzida probabilidade de aquisição de resistência por parte das bactérias.

Nesta nova estratégia irão ser utilizados processos biotecnológicos de aplicação simples e rápida, com objetivo de obter uma ação antimicrobiana duradoura, segura e com um amplo espetro de aplicação.

Os objetivos específicos são por conseguinte:

 Avaliar a eficácia da biofuncionalização através da capacidade dos AMPs selecionados se ligarem aos materiais têxteis através de interações iónicas;

 Detetar se os AMPs induzem modificações e danos na superfície das fibras;

 Avaliar o efeito antimicrobiano das amostras têxteis funcionalizadas com os AMPs;

 Avaliar o efeito citotóxico dos AMPs incorporados nos materiais têxteis, de forma a garantir o desenvolvimento eficaz e seguro de um novo método/material antibacteriano.

Capítulo 3