Análise de associação

Na Tabela 5 estão apresentadas as freqüências genotípicas e o número de animais genotipados para cada polimorfismo na geração F2.

Tabela 5 – Freqüências genotípicas e alélicas dos polimorfismos na geração F2

Freqüência genotípica2 Freqüência alélica

Polimorfismo N1 AA AB BB A B C789T 473 77,17 (365) 22, 83 (108) – 88,59 11,41 T828C 167 22,75 (38) 59,88 (100) 17,37 (29) 52,69 47,31 T2411C 445 31,46 (140) 53,26 (237) 15,28 (68) 58,09 41,91 T3266G 369 64,23 (237) 28,45 (105) 7,32 (27) 78,45 21,55 T3469C 506 86,36 (437) 13,64 (69) – 93,18 6,82 1

Número de animais genotipados.

2

Número de animais observados na classe genotípica.

Houve associação entre os cinco polimorfismos que estavam segregando na população F2 e várias características analisadas, o que sugere que a Leptina apresenta função fisiológica que influencia as características de composição da carcaça.

Nas Tabelas 6, 8, 10, 12 e 14 estão apresentados, respectivamente, os resultados das análises de associação dos polimorfismos C798T, C828T, C2411T, T3266G e T3469C com as características de carcaça, cortes e qualidade de carne. Por simplificação, os genótipos, para todas as enzimas, foram padronizados como AA (homozigotos para o alelo não-mutado), BB (homozigoto para o alelo mutado) e AB (heterozigoto).

Tabela 6 – Número de observações, média e desvio-padrão das características de carcaça e cortes associadas aos genótipos AA e AB para o polimorfismo C798T

Genótipo AA Genótipo AB Característica1 Sig2 N3 Média DP4 N Média DP

INTEST (m) 0,02 256 18,19 1,76 79 18,71 1,83

UL (mm) 0,06 257 28,21 5,94 81 26,91 5,28

PCARRE (kg) 0,01 259 3,50 0,49 83 3,37 0,37

1

INTEST – comprimento de intestino; UL - espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar; PCARRE – peso do carré.

2

Nível de significância pelo teste F.

3

Número de observações.

4

Desvio-padrão.

O polimorfismo C798T apresentou associação com comprimento do intestino, espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar (UL) e peso do carré. Os animais heterozigotos (AB) apresentaram maiores médias para comprimento de intestino e peso do carré, enquanto os animais normais (AA) mostraram maior média para espessura de toucinho UL.

Para comprimento de carcaça pelo método brasileiro de classificação de carcaça, peso do rim, profundidade do lombo, área de olho de lombo, gordura intramuscular, perda por gotejamento, índice de vermelho e tonalidade da carne, houve interação significativa entre genótipos e sexos. As médias de cada genótipo dentro dos sexos estão apresentadas na Tabela 7.

A existência da interação entre genótipo e sexo pode ser percebida nas características onde houve diferenças significativas entre os genótipos para um sexo e no outro sexo as médias genotípicas não diferiram estatisticamente. Por exemplo, para gordura intramuscular (GORINT) entre os machos houve diferença estatística entre os dois genótipos (AA e AB), enquanto nas fêmeas as médias não foram influenciadas pelos genótipos.

Tabela 7 – Médias dos genótipos AA e AB do polimorfismo C798T dentro de sexo Machos3 Fêmeas3 Característica1 Interação2 AA AB AA AB MBCC (cm) 0,05 85,19a 86,07a 86,58 a 85,75 a RIM (kg) <0,01 0,12 b 0,13a 0,13 a 0,12 b PFLOMB (mm) 0,05 42,72 a 43,40 a 46,38a 44,76b AOL (cm2) 0,07 25,18 a 25,38 a 28,65 a 27,20 b GORINT (%) 0,05 1,49 b 1,76 a 1,51 a 1,45 a GOTEJ (%) 0,04 3,35 a 2,76 b 3,21 a 3,53 a A 0,02 0,66 a 0,55 a 0,67 b 0,95 a H 0,06 84,44 a 85,25 a 84,10 a 81,69 b 1

MBCC – comprimento de carcaça pelo método brasileiro; RIM – peso do rim; PFLOMB – profundidade de lombo; AOL – área de olho de lombo; GORINT – gordura intramuscular; GOTEJ – perda de peso por gotejamento; A – índice de vermelho; H – tonalidade da carne.

2

Nível de significância da interação genótipo e sexo, pelo teste F.

3

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, dentro de cada sexo, diferiram pelo teste t (p < 0,05).

Tabela 8 – Número de observações, média e desvio-padrão das

características associadas aos genótipos AA, AB e BB para o polimorfismo C828T

Genótipo AA Genótipo AB Genótipo BB Característica1 Sig2 N3 Média4 DP5 N Média DP4 N Média DP PBDIR (kg) 0,06 33 27,00 a 2,74 78 26,86 b 3,01 19 27,03a 2,63 PBESQ (kg) 0,06 33 26,20 c 2,80 78 27,23 a 2,67 19 26,57 b 2,30 PCOPA (kg) 0,07 35 1,75a 0,24 80 1,69ab 0,29 19 1,62b 0,15 PTPALETA (kg) 0,02 34 4,87a 0,68 79 4,81a 0,71 19 4,58b 0,66 PBACON (kg) 0,03 34 2,68b 0,51 79 2,77b 0,47 19 2,96a 0,41 1

PBDIR – peso da banda direita ; PBESQ – peso da banda esquerda; PCOPA – peso da copa, PTPALETA – peso total da paleta ; PBACON – peso do bacon.

2

Nível de significância pelo teste F. 3

Número de observações. 4

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, diferiram pelo teste Tukey (P < 0,05) 5

Desvio-padrão.

O polimorfismo C828T foi o único na geração F2 que tinha sua origem nas fêmeas parentais; portanto, era esperado que os animais do genótipo BB apresentassem as maiores médias para as características ligadas à deposição de carne na carcaça e menores médias para características ligadas a

deposição de gordura, porém isso não foi observado. Os animais do genótipo AB apresentaram as melhores médias para peso da banda esquerda e menor para peso da banda direita, comparados aos genótipos AA e BB. Em se tratando de peso da copa limpa e peso total da paleta, os animais AA apresentaram as maiores médias; os heterozigotos, médias intermediárias; e os homozigotos para a mutação (BB), as menores médias. Para o peso de bacon, os animais AA apresentaram menores médias; os heterozigotos (AB), médias intermediárias; e os animais BB, as maiores médias. Possivelmente, o pequeno número de animais nas classes genótipicas AA e AB interferiram negativamente na estimativa dessa associação. Portanto, resultados mais acurados poderão ser obtidos incluindo na análise um número maior de animais.

Na Tabela 9 estão apresentadas as interações genótipo x sexo significativa entre o polimorfismo T828C e peso das bandas direita e esquerda e o comprimento de carcaça pelo método brasileiro. Observa-se, contudo, que as médias dos genótipos dentro de sexo não diferiram estatisticamente.

Tabela 9 – Médias de cada genótipo do polimorfismo T828C dentro de sexo

Machos3 Fêmeas3 Característica1 Interação2 AA AB AA AB PBDIR (kg) 0,03 26,97 a 26,79 a 27,03 a 27,87 a PBESQ (kg) 0,03 26,81 a 26,99 a 26,75 a 26,90 a MBCC (cm) 0,09 84,91 a 84,89 a 87,20 a 87,36 a 1

PBDIR - peso da banda direita; PBESQ - peso da banda esquerda; MBCC – comprimento de carcaça pelo método brasileiro de classificação de carcaça.

2

Nível de significância da interação genótipo e sexo, pelo teste F.

3

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, dentro de cada sexo, diferiram pelo teste t (p < 0,05).

O polimorfismo C2411T apresentou associação significativa com espessura de toucinho P2, peso do rim, peso da copa, peso da paleta limpa e peso do filezinho.

Tabela 10 – Número de observações, média e desvio-padrão das características de carcaça e cortes associadas aos genótipos AA, AB e BB para o polimorfismo C2411T

Genótipo AA Genótipo AB Genótipo BB Característica1 Sig2 N3 Média4 DP5 N Média DP N Média DP P2 (mm) 0,06 124 16,54 b 4,05 192 17,42 ab 3,70 60 17,55 a 3,68 RIM (mm) 0,01 125 0,13 a 0,02 196 0,13a 0,02 60 0,12b 0,01 PCOPA (kg) 0,09 123 1,72 a 0,28 198 1,68 ab 0,24 60 1,65b 0,20 PPALETA (kg) 0,05 125 2,75a 0,41 198 2,69ab 0,60 60 2,62b 0,36 FILEZIN (kg) 0,01 124 0,22b 0,04 197 0,22b 0,03 59 0,24a 0,04 1

P2 – espessura de toucinho a 6,5 cm da linha dorso-lombar; RIM – peso do rim ; PCOPA – peso da copa; PPALETA – peso da paleta; FILEZIN – peso do filezinho.

2

Nível de significância pelo teste F. 3

Número de observações. 4

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, dife riram pelo teste t (P < 0,05). 5

Desvio-padrão.

Em relação a peso da copa e peso da paleta limpa, os animais homozigotos normais apresentaram as maiores médias; os heterozigotos, médias intermediárias; e os homozigotos para a mutação C2411T, as piores médias. Para a espessura de toucinho P2, os animais homozigotos normais apresentaram menor média; os heterozigotos, desempenho intermediário; e os homozigotos para a mutação, a maior média. Esse comportamento está de acordo com a origem do polimorfismo. Considerando que o alelo mutado era originário da raça Piau, era esperado que ele estivesse associado às menores médias para deposição de carne e as maiores médias para deposição de gordura.

Observa-se interação significativa entre o polimorfismo T2411C e peso do rim, peso da cabeça, espessura de toucinho EL e maciez, como apresentado na Tabela 11.

No que se refere aos machos houve diferença estatística entre os genótipos para peso do rim e espessura de toucinho, enquanto nas os desempenhos foram semelhantes entre as três classes genotípicas.

Tabela 11 – Médias das características para cada sexo dentro de genótipos do polimorfismo T2411C Machos3 Fêmeas3 Característica1 Interação2 AA AB BB AA AB BB RIM (kg) 0,07 0,13a 0,13a 0,12b 0,13a 0,13a 0,13a CABECA (kg) 0,08 1,49a 1,49a 1,48a 1,59a 1,51b 1,51b MACIEZ (g/1,2cm) 0,06 5451a 5592a 5507a 5839a 5478a 5631a EL (mm) 0,05 44,50 b 45,45a 44,97ab 45,20 a 44,93 a 44,60a 1

RIM – peso do rim; CABECA – peso da cabeça; EL – menor espessura de toucinho na linha dorso-lombar; MACIEZ – maciez objetiva.

2

Nível de significância da interação genótipo e sexo, pelo teste F.

3

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, dentro de cada sexo, diferiram pelo teste t (p < 0,05).

Tabela 12 – Número de observações, média e desvio-padrão das características de carcaça e cortes associadas aos genótipos AA e AB para o polimorfismo T3266G

Genótipo AA Genótipo AB

Característica1 Sig2 N3 Média DP4 N Média DP

IDABATE (dias) 0,06 185 149,01 9,71 85 146,67 9,17 P2 (mm) 0,08 187 16,75 3,81 86 17,58 3,85 UC (mm) 0,04 187 19,41 4,71 86 20,65 4,80 UL (mm) 0,08 186 27,38 6,03 86 28,72 5,83 PCOPA (kg) 0,08 188 1,71 0,29 87 1,66 0,25 COSTELA (kg) 0,10 191 1,50 0,26 87 1,55 0,23 PBACON (kg) 0,05 189 2,67 0,46 86 2,75 0,37 1

IDABATE – idade ao abate; P2 – espessura de toucinho a 6,5 cm da linha dorso-lombar; UC – espessura de toucinho após a última costela; UL – espessura de toucinho entre a última e a penúltima vértebra lombar; PCOPA – peso da copa; COSTELA – peso da costela; PBACON – peso do bacon.

2

Nível de significância pelo teste F.

3

Número de observações.

4

Desvio- padrão.

Observa-se que os animais heterozigotos para o polimorfismo T3266G apresentaram as maiores médias para as espessuras de toucinho (P2, UC e UL) e peso da costela. Os animais AB também atingiram mais cedo a idade ao abate. Esse fato não era esperado, pois o polimorfismo T3266G tinha origem na raça Piau, uma raça não selecionada para características de carcaça e que apresenta menor desempenho produtivo. Entretanto, esses dados estão de

acordo com os resultados obtidos para o polimorfismo T3469C, pois para a característica peso ao abate os animais AB mostraram maiores médias, quando comparados aos animais AA. Por outro lado, os animais homozigotos para a mutação (AA) apresentaram as maiores médias para peso da copa e idade ao abate.

Houve interação significativa entre genótipo e sexo para o peso do baço e peso da banha rama (Tabela 13). Observa-se que entre os machos não houve diferença significativa entre os dois genótipos para o peso do baço, enquanto entre as fêmeas a média dos animais AA foi estatisticamente superior à dos animais AB. Para o peso da banha rama, nos machos houve diferença estatística entre os dois genótipos, ao passo que, entre as fêmeas, os dois genótipos mostraram desempenhos semelhantes.

Tabela 13 – Médias das características para cada sexo dentro de genótipos do polimorfismo T3266G Machos3 Fêmeas3 Característica1 Interação2 AA AB AA AB BAÇO (kg) 0,02 0,09 a 0,09a 0,10a 0,09 b BARAMA (kg) 0,01 0,49 b 0,54 a 0,44a 0,40a 1

BAÇO – peso do baço; BARAMA – peso da banha rama.

2

Nível de significância da interação genótipo e sexo, pelo teste F.

3

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, dentro de cada sexo, diferiram pelo teste t (p < 0,05).

Os animais portadores da mutação T3469C (genótipo AB) apresentaram as maiores médias de peso ao abate, espessura de bacon e tonalidade da carne, quando comparados aos animais AA. Considerando que o polimorfismo T3469C tinha sua origem em um dos machos da raça Piau, não era esperado que os animais heterozigotos para esta mutação apresentassem as melhores médias para peso ao abate. Possivelmente esses resultados podem ter sido causados pela existência de sobredominâcia entre os genótipos deste polimorfismo. Contudo, está hipótese não pode ser testada, uma vez que o genótipo homozigoto para a mutação apresentou baixa freqüência na geração F2 e não pode ser considerado na análise.

Tabela 14 – Número de observações, médias e desvio-padrão das características de carcaça, cortes e qualidade da carne associadas aos genótipos para o polimorfismo T3469C (AA e AB)

Genótipo AA Genótipo AB

Característica1 Sig2 N3 Média DP4 N Média DP

PVIVO (kg) 0,03 295 64,00 5,45 46 65,96 5,66 MBCC (cm) 0,10 334 86,20 4,2 55 85,32 4,09 MLC (cm) 0,04 331 71,72 3,22 54 70,91 3,29 CORACAO (kg) 0,06 334 0,24 0,02 54 0,23 0,03 FIGADO (kg) 0,05 333 1,27 0,16 54 1,22 0,13 ESPBACON (mm) 0,03 338 24,77 6,68 54 26,76 6,27 A 0,02 280 0,76 0,64 45 0,63 0,51 H 0,03 254 83,57 6,00 42 85,77 4,18 1

PVIVO – peso ao abate; MBCC – comprimento de carcaça pelo método brasileiro de classificação de carcaça; MLC – comprimento Método Americano; ESPACON – espessura de bacon; A – índice de vermelho; H – tonalidade.

2

Nível de significância pelo teste F.

3

Número de observações.

4

Desvio-padrão.

Dos polimorfismos analisados, apenas o polimorfismo T3469C mostrou alguma associação com características de qualidade da carne. A mutação T3469C apresentou associação com as características índice de vermelho e tonalidade da carne. Lagonigro et al. (2003) relataram a associação de um polimorfismo no gene da Leptina com teor de gordura intramuscular em bovinos. Contudo, não há estudos que investigaram a associação da Leptina com outras características de qualidade de carne, além da gordura intramuscular.

Na Tabela 15 estão apresentadas as interações significativas entre genótipo e sexo, em se tratando das espessuras de toucinho UC e P2, peso do pernil, peso da paleta e peso do carré.

Em relação aos machos, não houve diferença estatística entre as classes genotípicas AA e AB para espessura de toucinho UC e peso do pernil limpo. Para as fêmeas houve diferença significativa entre os genótipos; as fêmeas da classe genotípica AA apresentaram maior média para espessura de toucinho UC e menor para peso do pernil limpo. Entre as fêmeas não houve diferença estatística entre as duas classes genotípicas no que se refere a

espessura de toucinho P2 e peso da paleta limpa. Entre os machos houve diferença estatística entre os genótipos. Os animais da classe AA apresentaram menor média para a espessura de toucinho P2 e maior média para peso da paleta limpa.

Tabela 15 – Médias de cada genótipo do polimorfismo T3469C dentro de sexo Machos3 Fêmeas3 Característica1 Interação2 AA AB AA AB UC (mm) 0,06 21,17a 21,51a 18,71a 16,82b P2 (mm) 0,01 18,32b 19,98a 15,47a 14,77a PPERNIL (kg) 0,01 4,80a 4,71a 5,16b 5,38a PPALETA (kg) 0,05 2,61a 2,46b 2,78a 2,81a PCARRÉ (kg) 0,03 3,49a 3,57a 3,49a 3,37a 1

UC – espessura de toucinho após a última costela; P2 – espessura de toucinho a 6,5 cm da linha dorso-lombar; PPERNIL – peso do pernil; PPALETA – peso da paleta; PCARRE – peso do carré.

2

Nível de significância da interação genótipo e sexo, pelo teste F.

3

Médias seguidas por letras diferentes, na mesma linha, dentro de cada sexo, diferiram pelo teste t (p < 0,05).

A fim de explicar a associação entre polimorfismos e as características, foram apresentadas três hipóteses. Na primeira admitiu-se que os polimorfismos seriam diretamente responsáveis pela variação observada nas características. Assim, tais polimorfismos poderiam estar envolvidos na formação de uma proteína (Leptina) mais ou menos eficiente. Essas mutações poderiam interferir em vários níveis da expressão do gene da Leptina, ou seja, na transcrição, no processamento, no transporte ou até mesmo na meia-vida da proteína circulante.

A maioria dos polimorfismos estudados estava localizada em regiões não-expressas do gene. Somente o polimorfismo T3469C estava dentro de uma região de exon. Apesar de os polimorfismos localizados em região de

exon terem maior probabilidade de apresentar efeitos biológicos sobre a

expressão gênica, é possível que polimorfismos localizados em regiões não- expressas sejam capazes de interferir na expressão do gene.

Na segunda hipótese, admitiu-se que o polimorfismo estaria em desequilíbrio de ligação com outro polimorfismo, que seria o verdadeiro sítio causal da variação observada nas características analisadas.

De acordo com o mapeamento do cromossomo 18 de suínos (SSC18), observa-se que próximo ao loco do gene da Leptina está o loco do gene do neuropeptídeo Y (NPY), que tem ação antagonista em relação à Leptina e que também poderia ser considerado como um gene candidato que influencia características de desempenho em suínos. Além do NPY, outros locos localizados neste cromossomo poderiam ser os responsáveis pela variação encontrada nas características estudadas. Caso esta segunda hipótese seja verdadeira, esses polimorfismos no gene da Leptina serviriam como marcadores para o verdadeiro sítio causal das variações.

A terceira hipótese foi a existência de associações falso-positivas. O modelo estatístico usado pressupõe que apenas os polimorfismos e os efeitos fixos e aleatórios estejam influenciando na média das características. Contudo, sabe-se que a variação nessas características é controlada por muitos fatores, inclusive os ambientais. Outro fato que poderia levar a essas associações falso-positivas é o número limitado de observações para alguns dos genótipos.

Apesar da importância da Leptina no metabolismo, de forma geral, o efeito dos polimorfismos nesse hormônio foi relativamente pequeno sobre a variação total das características em que foi constatada a associação. Talvez isso se deva ao fato de os animais terem sido abatidos aos 65 kg de peso vivo, quando eles ainda não estavam em fase de deposição acelerada de tecido gorduroso. Provavelmente, se o abate dos animais tivesse ocorrido por volta de 100 kg de peso vivo, quando os animais depositam mais gordura, os efeitos dos polimorfismos no gene da Leptina teriam sido de maior amplitude, pois sabe-se que a expressão da Leptina é altamente correlacionada com o conteúdo de gordura corporal (HOUSEKNECHT ET AL., 1998). Ramsay et al. (1998), testando a hipótese de que a expressão do gene da Leptina variava com a deposição da gordura, mediram a concentração da Leptina sérica em indivíduos selecionados para maior espessura de toucinho e compararam com a expressão de indivíduos selecionados para menor espessura de toucinho. Estes autores observaram que no grupo de indivíduos obesos os níveis de

Leptina estavam aumentados em 306% (p<0,05), em relação ao grupo não selecionado. Outra possível causa do pequeno efeito desses polimorfismos seria a localização da maioria deles em regiões não-expressas do gene pequeno efeito.

Na população estudada, foram medidas espessuras de toucinho em vários locais ao longo da carcaça. Benevenuto Júnior (2001) encontrou correlações próximas de 70% entre essas medidas. Apesar da correlação relativamente alta entre as espessuras de toucinho, os polimorfismos mostraram associação com algumas e não com todas. O polimorfismo T3266G apresentou associação significativa com três espessuras (P2, UC e UL); o polimorfismo T2411C, com a espessura P2; e o polimorfismo C798T, somente com a espessura UL.

Rohrer e Keele (1998), investigando a presença de QTLs influenciando a composição de carcaça, concluíram que diferentes conjuntos de genes, não totalmente exclusivos, atuam na expressão da deposição de gordura ao longo da carcaça do animal, demonstrando a expressividade variável dos genes, a qual depende do número de genes controladores e da atividade desses genes.

A expressividade variável dos genes pode ser responsável pelo padrão de expressão observado para o polimorfismo T3469C. Este polimorfismo apresentou efeito negativo sobre as médias dos pesos em idades mais jovens (P21, P42, P63 e P77) e efeito favorável sobre a média do peso ao abate, quando os animais tinham cerca de 150 dias de idade.

Apesar da importância fisiológica do hormônio Leptina no metabolismo energético, são poucos os estudos envolvendo a associação entre polimorfismos neste gene e características produtivas em animais domésticos. Jiang & Gibson (1999), estudando o polimorfismo da T3469C em diferentes raças, observaram associação com espessura de toucinho na raça Large White (p=0,0017), estando o polimorfismo associado à maior espessura de toucinho. Kennes et al. (2001) encontraram associação entre o polimorfismo T3469C e consumo alimentar (p=0,0078) na raça Landrace. Estes autores também encontraram associação entre o polimorfismo A2845T e a idade para atingir 100 kg (idade ao abate).

Freqüentemente, os dados de associação entre polimorfismos e características fenotípicas são conflitantes na literatura. Em parte, esses resultados podem ser atribuídos às diferenças na origem das raças analisadas. Por isso, deve haver cautela na extrapolação dos resultados obtidos em uma raça para outras raças. A variação nas características quantitativas é determinada pela interação entre diversos genes e destes com o ambiente.

A Leptina é diferencialmente expressa entre os sexos (Spicer, 2001). Segundo Martin et al. (2002), em humanos, o efeito de sexo sobre a expressão da Leptina é bastante significativo, pois, com as mesmas quantidades de gordura corporal, mulheres secretam duas vezes mais Leptina que homens. Esse dimorfismo poderia estar associado ao efeito diferenciado entre machos e fêmeas dos polimorfismos no gene da Leptina.

Uma vez que a expressão da Leptina em humanos é diferenciada entre os sexos, é provável que em suínos os efeitos da Leptina também o sejam. Os resultados obtidos neste estudo reforçam essa hipótese. Observou-se que as diferenças entre os genótipos variaram entre machos e fêmeas.

Considerando a existência da interação genótipo e sexo, os marcadores podem ter eficiência diferenciada para seleção de machos ou de fêmeas. Portanto, o efeito da interação genótipo x sexo deverá ser incluído no modelo estatístico, aumentando a acurácia da avaliação desses marcadores genéticos.