Análise das atividades de Pic in vitro

4.12.1 Clivagem de moléculas do complemento

Um ensaio de sobrevivência também foi realizado com a cepa BA589 para verificar se a mesma possuía atividade bactericida. Conforme mostrado na figura 32, a cepa em estudo foi

capaz de sobreviver à atividade bactericida do soro humano, diferente da cepa DH5α.

Figura 32 - Ensaio de sobrevivência da cepa BA589 e DH5α.

Após cultivo bacteriano a 37 °C, as cepas BA589 e DH5α foram incubadas a 37 °C por 5, 10, 15, 30 e 60 min com soro humano ativado ou previamente inativado. Em seguida foram semeadas em placas contendo ágar LB e incubadas a 37 °C por 18 h para determinação do número de unidades formadoras de colônias (UFC).

Tendo em vista que o mecanismo de ação da serinoprotease secretada por EAEC sobre o sistema complemento não foi elucidado e que a cepa BA589 também se mostrou resistente à atividade bactericida do soro humano, o objetivo desta etapa foi analisar o possível papel de Pic nesse processo. Para tanto, algumas moléculas-chave das três vias do sistema complemento (C1q, C2, C3 e C4) foram utilizadas nos ensaios de incubação com a serino protease Pic. A avaliação foi realizada mediante a detecção dos produtos de clivagem de moléculas do sistema complemento após incubação com o sobrenadante de cultura das cepas BA589 e BA589∆pic. A figura 33 mostra esses produtos de clivagem apenas nas incubações com o sobrenadante de cultura da cepa BA589. As incubações realizadas com a cepa mutante BA589∆pic, assim como as do controle negativo com PBS, não mostraram clivagem das moléculas C2, C3 e C4. Com relação à molécula C1q, não houve clivagem em nenhuma das incubações, indicando que a proteína Pic não possui atividade sobre esta molécula.

Figura 33 - Clivagem de moléculas do sistema complemento.

Os sobrenadantes de cultura das cepas BA589 e BA589Δpic1 foram incubados por 5 h a 37 °C com moléculas do complemento e em seguida as amostras foram aplicadas em SDS-PAGE (10%) e após separação foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A imunodetecção foi realizada utilizando anticorpos específicos, seguido da revelação com o kit

ECLTM Western Blotting Analysis System (GE Healthcare). As imagens correspondem aos

filmes de raios-X após exposição ao immunoblotting, seguida de revelação e fixação. As setas ao lado de cada figura correspondem às bandas de clivagens das moléculas do sistema complemento.

Assim, pela clivagem direta de proteínas importantes para a ativação das três vias do sistema complemento, a proteína Pic promove resistência à atividade bactericida do soro e contribui para que patógenos produtores desta serinoprotease consigam evadir ao sistema imune do hospedeiro.

Para compreender de maneira mais abrangente este processo de interação de Pic com proteínas do sistema complemento, o presente estudo foi ampliado empregando a proteína Pic da cepa protótipo de EAEC 042, a qual possui identidade de 99% em nível de aminoácidos com a Pic da cepa BA589.

Pic042 foi capaz de clivar as moléculas C3b e C4b, e assim como Pic589, promoveu a

clivagem direta de outras proteínas da via clássica e das lectinas, como C2, C3 e C4. Fragmentos de clivagem dessas moléculas também foram observados após a incubação destas moléculas com sobrenadantes de cultura de HB101(pPic1). Os fragmentos de clivagem de C3 foram mapeados utilizando peptídeos FRET (fluorescence resonance energy transfer peptides). Um ensaio utilizando o soro humano como fonte de proteínas do complemento

confirmou a atividade proteolítica de Pic sobre estas proteínas. Além disso, Pic atuou em conjunto com o fator I e fator H, que são moléculas reguladoras do sistema complemento, promovendo, assim, a inativação da molécula de C3b, conforme esquema apresentado na figura 34.

Esses resultados com a Pic042 fazem parte do artigo apresentado no Anexo B (ABREU

et al., 2015), resultante do presente estudo.

4.12.2 Atividade de hemaglutinação

Ensaios prévios realizados por Henderson et al., (1999) mostraram que Pic produzida por EAEC 042 promove a hemaglutinação de hemácias de rato, carneiro, porco e coelho, sendo mais intensa nesta última espécie. Desta forma, para confirmar se a serinoprotease Pic da cepa BA589 estava ativa, hemácias de coelhos foram obtidas comercialmente e incubadas com preparações de Pic589, Pic042 e com os sobrenadantes de cultura das cepas BA589 e

BA589∆pic. A inibição da hemaglutinação também foi realizada com adição prévia de anticorpos anti-Pic às incubações.

Conforme mostrado na tabela 5, todas as preparações contendo Pic promoveram a hemaglutinação das hemácias de coelho. Contudo, a perda dessa atividade foi observada quando anticorpos anti-Pic foram adicionados à reação. Esse mesmo efeito foi observado com o sobrenadante de cultura da cepa BA589∆pic. Desta forma, estes dados confirmam os dados da atividade de hemaglutinação obtidos previamente para uma cepa de EAEC. Além disso, mostram que a proteína purificada por gel filtração estava ativa e que na cepa em estudo outras proteínas secretadas não promovem a hemaglutinação das hemácias de coelho, uma vez que o sobrenadante de cultura do mutante não possui atividade de hemaglutinação.

Tabela 5 - Atividade de hemaglutinação da Proteína Pic.

Preparações Hemaglutinação

Pic042 +

PicBA589 +

PicBA589 pretratada com anticorpo anti-Pic -

BA589 (sobrenadante de cultura) +

BA589Δpic (sobrenadante de cultura) -

Preparações de Pic foram incubadas com hemácias de coelho para analisar a atividade de hemaglutinação. Apenas aglutinação visível das hemácias foi considerada como resultado positivo.

4.12.3 Atividade mucinolítica

Para analisar a atividade mucinolítica, Pic purificada das cepas BA589 e 042, bem como o sobrenadante de cultura de BA589∆pic foram incubados com mucina de glândula submaxilar bovina. Após coloração com amido-black, halos de lise foram observados ao redor do local onde as amostras foram aplicadas. Apenas as amostras que continham Pic promoveram degradação da mucina, o que não pôde ser observado com o sobrenadante de cultura do mutante BA589∆pic (Figura 35).

Figura 35 - Atividade mucinolítica da proteína Pic.

Zonas de lise em mucina de glândula submaxilar bovino foram visíveis após tratamento com Pic (PicBA589 e Pic042) e coloração com amido-black. Nenhuma lise foi observada quando a

mucina foi incubada com preparações do mutante BA589Δpic.