Análise por Biologia Molecular

4.2.7.1 Análise das condições ambientais da região de coleta das amostras

As informações sobre as condições ambientais foram obtidas por dados oficiais do IBGE (Brasil, 2012). O pH foi obtido pelo método colorimétrico.

4.2.7.2 Coleta dos dentes e das vértebras

Após a exumação dos esqueletos, os crânios foram separados e foram removidos um ou dois dentes, preferencialmente o molar, para análise do DNA. Os elementos dentários foram retirados com auxílio de extratores e armazenados em potes de plástico até o momento da extração do DNA. Nos casos em que os elementos dentários estavam ausentes, foram removidas duas ou três vértebras para extração de DNA. Estas foram armazenadas em sacos plásticas até a extração.

É importante descrever que tanto os dentes como as vértebras apresentavam-se molhadas, com muita sujeira advinda do contato com o solo úmido. Especialmente as vértebras estavam esbranquiçadas em alguns pontos e amareladas em outros, com aparência oca e escavada. Os dentes, na sua maioria, tinham cáries, restaurações, descalcificações e desgastes na oclusal. A situação de cada elemento foi descrita para confronto com os resultados. Assim, os dentes e as vértebras foram classificados em condição ruim, caso apresentassem qualquer tipo de alteração e condição boa, quando estavam regulares e satisfatórios para a análise por DNA.

4.2.7.3 Preparo dos dentes

Os dentes foram submetidos a um processo de limpeza físico-química através da realização de raspagens com curetas periodontais e lavagem com álcool 70%. Em seguida, foram acondicionados em potes plásticos e mantidos à temperatura negativa de 20ºC. Os dentes foram seccionados em sua porção coronária com disco de carborundo esterilizado, substituído para cada unidade e depois, pulverizados. Foi realizado o método de Sweet e Hildebrand(1998) adaptado com o uso de um grau e pistilo de porcelana e estocagens manuais. Para a pulverização dos elementos dentários foram realizadas de 3 a 4 imersões em nitrogênio líquido mantendo as batidas do pistilo constantes. Foi utilizada de 1 a 5 g de cada amostra dentária pulverizada.

4.2.7.4 Preparo das vértebras

O preparo das vértebras obedeceu ao protocolo descrito por Kemp e Smith (2005). As vértebras foram limpas agressivamente com uma lixa para remover a camada exterior de material estranho e qualquer contaminação que pudesse interferir na análise por DNA. Os fragmentos ósseos foram limpos com álcool e água sanitária diluída por 20 minutos e enxaguados com água destilada estéril. Em seguida, foram fragmentados em pedaços muito pequenos utilizando serra manual de fita. Os pedaços de ossos foram, então, secos ao ar. Utilizou-se de 1 a 5 g de amostra óssea pulverizada.

4.2.7.5 Extração do DNA

A extração do DNA dos dentes e das vértebras foi realizada de acordo com as instruções do fabricante do Kit QIAamp DNA Investigator Kit, da marca Qiagen (Quiagen™).

Após a extração do DNA, procedeu-se com a corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, juntamente com um marcador de peso molecular de 100 pares de bases e visualização da imagem fotografada para confirmar presença de material genético (gel de integridade). Previamente a aplicação da técnica de PCR, realizou- se a quantificação do DNA no equipamento Espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific™) (Anexo F).

4.2.7.6 Reações de PCR e primer utilizado

Conforme relatado (Farah, 2007), a técnica conhecida como PCR é baseada na estrutura e na sequência do DNA. Na prática o que se faz é adicionar em um tubo de ensaio uma quantidade pequena de DNA genômico, mais os quatro nucleotídeos que compõem a cadeia de DNA (dCTP, dATP, dGTP e dTTP), a enzima polimerase do DNA, os oligonucleotídeos que servirão de primers e a solução-tampão (fornece as condições de pH e salinidade necessárias).

Procede-se ao aquecimento da molécula de DNA (dupla hélice) à temperatura de 94oC por cinco minutos, para que suas pontes de hidrogênio se quebrem e, há a separação das hélices, processo denominado de desnaturação. Quando esta solução é vagarosamente resfriada (30o_{C a 65}o_{C por 30 segundos), cada hélice} encontra-se com sua complementar e a estrutura de dupla hélice reconstitui-se, processo conhecido como anelamento, permitindo a hibridização entre a hélice (que é unitária) e o primer presente no meio.

Com o novo aumento da temperatura (72o_{C por 30 segundos a 2 minutos), a} enzima TaqDNA polimerase, fornece energia à reação, incorporando o nucleotídeo na posição terminal do primer, promovendo a elongação da cadeia, sendo este o processo de extensão. O conjunto de reações em série de desnaturação, anelamento e extensão é definido como um ciclo que resulta na amplificação da sequência de DNA desejada.

A região escolhida para amplificação pela técnica de PCR foi a amelogenina, cuja seqüência de primers está apresentada no Quadro 4.2. Os primers foram sintetizados pela empresa Life Technologies Brasil Comércio e Indústria de Produtos

para Biotecnologia LTDA, sendo um marcado com fluorescência 6FAM e o outro não marcado.

Importante ressaltar aqui que, apesar da amelogenina representar uma região funcional do DNA (gene), a mesma foi utilizada exclusivamente com fins de estimativa de sexo para identificação humana, sendo que não foi observado, durante o andamento desta pesquisa, nenhum outro tipo de característica dos indivíduos envolvidos.

Nome do Primer Sequência 5’- 3’

AMEL F GTTTCTTCCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG

AMEL R ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG [6-FAM]

Quadro 4.2 - Sequência, concentrações e tamanho dos produtos das PCR do loci amelogenina

Para a reação de PCR, foi utilizado o Termociclador Veriti 96 well (Applied Biosystems™). Foi obtida uma mistura com volume total de 15µL, contendo água, tampão, dNTPs, Primer, DNA polimerase e DNA molde, conforme explicitado no Quadro 4.3. Como controle positivo foi utilizado DNA humano advindo do sangue, após comprovado sua efetividade. Já o controle negativo consistiu na substituição do DNA por água, assim sendo possível detectar possíveis contaminações de alguns dos reagentes requisitados para a reação de PCR. A ciclagem utilizada está descrita no Quadro 4.4. REAGENTES CONCENTRAÇÃO Tampão 2X MgCl2 50mM dNTP 10mM Primer F 1µM Primer R 1µM Taq 5U DNA 100ng Agua -

PROGRAMA TEMPERATURA TEMPO CICLOS Hot-start 95ºC 10’ Desnaturação 94ºC 30” Hibridização 54ºC 1’ 40 ciclos Extensão 72ºC 1’ Extensão final 72ºC 60’

Quadro 4.4 - Ciclagem padrão utilizada nas reações de PCR

4.2.7.7 Análise de fragmento

Após a PCR, uma quantidade de 1µL do produto de cada amostra foi acrescido de 9µL de formamida HI-DI (altamente deionizada) e de 0,3µL de LIZ 600 e prosseguiu-se a análise de fragmento no sequenciador ABI 3500 (Applied Biosystems™). Foi utilizado o software GeneMapper (Applied Biosystems™) para a análise.

4.2.7.8 Análise estatística da Metodologia que utiliza DNA

Os dados obtidos através do uso da Biologia Molecular para amelogenina foram estudados estatisticamente por análise descritiva.

5 RESULTADOS

Todas as medidas obtidas com os métodos antropológicos, bem como os resultados com a análise de DNA estão apresentados no Anexo G.