Análise de curvas de hidrólise por EC

Com o estabelecimento do método eletroforético, foi testada a possibilidade de realizar o acompanhamento do processo hidrolítico dos polissacarídeos de

Kappaphycus alvarezii (kappa-carragenana) através da análise de alíquotas

coletadas em diferentes tempos da hidrólise redutiva parcial.

Para este experimento foi realizado o seguinte procedimento:

primeiramente foi preparada uma solução para realização da hidrólise redutiva parcial de uma kappa-carragenana, de acordo com o método estabelecido por USOV e ELASHVILI (1991). A mistura foi então incubada a 60ºC, sendo retirada uma alíquota antes da incubação. Outras alíquotas foram então seqüencialmente retiradas em intervalos de 1 h, a partir de duas horas de hidrólise. Desta forma, foram retiradas alíquotas nos tempos de 0 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h e 8 h.

Cada alíquota foi submetida a uma seqüência de purificação (Figura 61 A),

com o intuito de diminuir os subprodutos da hidrólise:

• Eliminação do TFA: o TFA (volátil) é eliminado por evaporação das

alíquotas para encerrar definitivamente a hidrólise.

• Eliminação do 4-MMB: o resíduo de evaporação é ressuspenso em

água e aplicado a uma resina catiônica (forma H+). A metilmorfolina

(subproduto do 4-MMB) é uma amina terciária e, desta forma, se apresentará protonada em solução aquosa em praticamente todas as

faixas de pH. Assim, a metilmorfolina protonada se liga à resina catiônica, enquanto os oligossacarídeos são eluidos livremente.

• Remoção dos resíduos insolúveis: o eluato da resina catiônica é

liofilizado, ressuspenso em água e submetido à centrifugação para remoção dos resíduos insolúveis. Estes resíduos podem levar ao entupimento do capilar, desta forma faz-se uma filtragem em

membrana de 0,2 µm para garantir a ausência de partículas

insolúveis na solução .

• A partir daí, as alíquotas purificadas são submetidas à anállise por

EC, de acordo com o método estabelecido (Figura 61 C).

Mesmo tendo somente carrabiitol 42-sulfato e carratetraitol-42,44-dissulfato

como padrões para a análise do hidrolisado da kappa-carragenana, foi possível deduzir a estrutura química dos outros oligossacarídeos detectados. Isto porque o polissacarídeo usado como material de partida para hidrólise é uma kappa-

carragenana pura, sendo constituída por díades repetitivas de [β-D-Galp 4-sulfato-

(1→4)-3,6-An-α-D-Galp-(1→3)] por toda extensão da cadeia polimérica. Deste

modo, a hidrólise redutiva parcial (que somente cliva as ligações 3,6- anidrogalactosídicas) vai gerar somente oligossacarídeos alditóis de número de unidades par, com uma unidade de 3,6-anidrogalactitol como terminal. Primeiramente determinou-se, por tempo de retenção, os picos correspondentes aos oligossacarídeos padrões (di- e tetrassacarídeo) nos eletroferogramas da curva de hidrólise. Depois é possível concluir que os picos subseqüentes correspondem aos hexa-, octa-, decassacarídeos, sempre aumentando a cadeia

oligossacarídica por inserção de unidades dissacarídicas (Figura 61 B e D). A

análise eletroforética das alíquotas coletadas durante a hidrólise (Figura 61 C)

mostrou a presença de oligossacarídeos com até quatorze unidades monossacarídicas.

Figura 61: Esquema da curva de hidrólise redutiva parcial da kappa-carragenana

através de EC. (A) hidrólise, divisão em alíquotas e purificação. (B) padrões

utilizados para a análise dos eletroferogramas da curva de hidrólise (carrabiitol 42-

sulfato e carratetraitol-42,44-dissulfato). (C) eletroferogramas correspondentes aos

tempos de hidrólise. (D) Estrutura da kappa-carragenana e indicação dos pontos

Através do monitoramento do processo hidrolítico, foi possível encontrar tempos de hidrólise ideais para a obtenção de oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização.

Deste modo, com o sucesso do experimento de determinação de curvas de hidrólise por EC, foi realizado o mesmo procedimento para mais dois modelos polissacarídicos: agarose 6-sulfato (Gracilaria dominguensis) e uma theta- carragenana (Gigartina skottsbergii). A partir dos eletroferogramas apresentados

na Figura 62, pode-se observar os graus de hidrólise num mesmo tempo, foram

Figura 62: Eletroferogramas correspondentes a alguns tempos de hidrólise redutiva parcial de 3 diferentes polissacarídeos: (A) kappa-carragenana; (B) agarose 6-sulfato e (C) theta-carragenana.

A agarana 6-sulfatada foi o polissacarídeo que sofreu hidrólise mais rápida; em 8 h de hidrólise, todo polissacarídeo já havia sido convertido à dissacarídeos. A kappa-carragenana já apresentava oligossacarídeos de poucas unidades (duas e quatro) no tempo de uma hora, mas em proporção bem menor que àquela da agarana 6-sulfatada e, no tempo de 8 h, ainda haviam oligossacarídeos de seis e oito unidades em proporção considerável na solução hidrolítica. A theta-carragena foi o polissacarídeo que apresentou maior resistência à hidrólise redutiva parcial; somente no tempo de 10 horas começaram a ser detectados os primeiros oligossacarídeos formados.

Da análise desses resultados, infere-se que a posição do grupo sulfato no polissacarídeo interfere na ação hidrolítica, sendo que, quanto mais próximo este grupo estiver da ligação glicosídica, mais difícil é a ação hidrolítica e mais tempo levará para que a ligação seja rompida, sendo necessário o prolongamento do tempo de hidrólise. Estas observações são consistentes com as conclusões

alcançadas durante o processo de obtenção dos oligossacarídeos (ítem 4.2.5.).

A combinação da eletroforese capilar juntamente com a estratégia de detecção permitiu a obtenção de eletroferogramas de alta resolução para estruturas muito similares. Além disto, o processo de preparo de alíquotas proveniente de diferentes tempos de HRP, proporcionou o monitoramento da formação dos oligossacarídeos alditóis para diferentes modelos polissacarídicos. Desse modo, as condições desenvolvidas neste trabalho podem ser uma ferramenta eficiente para obtenção de oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização e para o estudo de galactanas de algas marinhas com padrão de sulfatação mais heterogêneo.