Como foi referido anteriormente, observou-se uma diferença significativa entre a constante da velocidade de consumo das células RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5 e os seus controlos (RPE-1 e RPE-1 GFP), ver figura III.2. Com o objectivo de compreender de que modo os níveis mais elevados de proteína TBCCD1 influenciam o consumo intracelular de H2O2 procedeu-se (i) à analise do tamanho destas células e (ii) ao estudo da constante de velocidade de consumo do H2O2 pelo catalase.
II.1. Análise do tamanho das células RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5
Uma vez que, no silenciamento do gene tbccd1 em células RPE-1 se observou um aumento do tamanho destas (Gonçalves et al, 2010) e, atendendo que a linha celular RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5 ainda não tinha sido caracterizada, um possível aumento do tamanho celular poderia levar aos resultados observados. Isto porque, ao existir um tamanho maior das células por consequência existirá uma maior área de membrana plasmática pelo que a difusão do H2O2 se dará de um modo mais eficaz (Antunes & Cadenas, 2000).
Deste modo caracterizou-se o tamanho destas células por citometria de fluxo através das funcionalidades Side Scatter e Forward Scatter.
Com base na representação da Forward Scatter em função de Side Scatter é possível identificar o tamanho médio da população de um conjunto de células e separá-las em diferentes sub-conjuntos consoante o tamanho.
Pela análise dos resultados obtidos (resultados não apresentados) observou-se que a linha celular RPE-1 apresenta uma heterogeneidade de tamanhos das células. Porém, a linha celular RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5 apresenta essencialmente um único tamanho celular, o qual corresponde a um dos maiores tamanhos presente na população de células heterogéneas detectada na linha RPE-1. Assim, as células RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5 não são maiores do que as células controlo, todavia constituem uma população mais homogénea de células com um tamanho semelhante ao maior encontrado na população heterogénea das células RPE-1. Este facto pode ser compreendido devido à linha celular RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5 ser uma
linha monoclonal obtida por cell sorter, isto é, proveniente a partir de uma única célula RPE-1 infectada com as partículas virais que continham o gene tbccd1, a qual provavelmente era uma célula “ relativamente maior” às demais.
O presente resultado mostra que o tamanho das células RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5 não se encontra alterado pela sobre-expressão da proteína de fusão. Todavia, e tendo em conta que a constante da velocidade de consumo intracelular de H2O2 é proporcional à área celular e que esta foi determinada em ambas as linhas celulares (RPE-1 e RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 5) para um igual número de células (1,7×106 células), existe efectivamente uma maior área de membrana nas células do clone 5 comparativamente ao seu controlo (RPE-1), podendo-se assim justificar a diferença dos resultados de consumo descritos anteriormente.
A análise de tamanho nas células RPE-1 TBCCD1-GFP Clone 10 e 6, linhas celulares produzidas de modo análogo ao clone 5 mas com expressão de diferentes níveis de TBCCD1- GFP poderá ajudar a esclarecer a relação constante da velocidade de consumo intracelular de H2O2, área celular e níveis de TBCCD1.
II.2. Ensaio cinético do catalase
Atendendo que o consumo intracelular de H2O2 depende da velocidade de degradação do H2O2 e que o catalase é um dos primeiros e principais enzimas a actuar na remoção deste (revisto em Oliveira-Marques et al, 2008), procedeu-se à determinação da constante de velocidade de consumo de H2O2 pelo catalase de forma a compreender se o metabolismo de degradação do H2O2 se encontrava alterado pelo aumento dos níveis do TBCCD1.
Na figura III.3 encontram-se apresentados os resultados obtidos para a actividade do catalase de células RPE-1 a sobre exprimir a proteína de fusão TBCCD1-GFP permeabilizadas com 1mg/mL de digitionina. A digitionina a esta concentração permite a permeabilização, quer da membrana plasmática, quer da membrana dos restantes organelos, nomeadamente do peroxissoma onde este enzima se localiza maioritariamente.
Pela análise da figura III.3 observou-se que o aumento de quantidade do TBCCD1 leva a um ligeiro aumento da constante de velocidade de consumo de H2O2 pelo catalase. Contudo, é necessário um maior número de experiências para analisar se existe ou não uma diferença estatisticamente significativa para o aumento observado.
Figura III.3: Constantes de velocidade de consumo de H TBCCD1-GFP Clone 5, RPE-1 e RPE
permeabilizadas com 1 mg/mL de digitionina, foi seguido ao longo do tempo. A constante d deste é obtida através do declive da recta ajustada aos pontos experimentais. Em
representadas a média e o respectivo desvio padrão dos valores obtidos em 3 experiências independentes, cada uma em duplicado. A projecção destes f
A possibilidade de o TBCCD1 poder influenciar a actividade do enzima catalase, isto é, o metabolismo do H2O2, apoia o facto de parecer existir uma relação entre os níveis de proteína TBCCD1 presentes nas diferentes linhas RPE
TBCCD1-GFP e a constante de velocidade de consumo do H “Determinação da constante de velocidade de consumo de H expressam a proteína de fusão TBCCD1
Caso se confirme uma diferença, estatisticamente significativa, entre a constante de velocidade de consumo de H2O2 pelo catalase destas células com o respectivos controlos, dever determinar a actividade deste enzima para as linhas celulares RPE
6, células que sobre-expressam diferentes níveis de TBCCD1 validar a relação entre o TBCCD1 e o metabolismo do H
O glutationo peroxidase é outro enzima igualmente responsável pela rápida metabolização do H2O2 (Oliveira-Marques et al
velocidade de consumo de H2
papel do TBCCD1 na regulação da remoção do H
Como referido na introdução d
plasmática é definido com a razão entre a soma das actividades dos enzimas que consomem o H2O2, em células permeabilizadas, e o seu consumo em células intactas. A sua determinação permite conhecer a concentração de H
(Antunes & Cadenas, 2000). Seria analogamente interessante determinar o gradiente de H nas linhas celulares que sobre
Constantes de velocidade de consumo de H2O2 pelo catalase em células RPE
1 e RPE-1 GFP Clone 10. O consumo de H2O2 de 0,25 permeabilizadas com 1 mg/mL de digitionina, foi seguido ao longo do tempo. A constante d deste é obtida através do declive da recta ajustada aos pontos experimentais. Em
representadas a média e o respectivo desvio padrão dos valores obtidos em 3 experiências independentes, cada uma em duplicado. A projecção destes figura em B.
A possibilidade de o TBCCD1 poder influenciar a actividade do enzima catalase, isto é, o , apoia o facto de parecer existir uma relação entre os níveis de proteína TBCCD1 presentes nas diferentes linhas RPE-1 que sobre-expressam a proteína de fusão GFP e a constante de velocidade de consumo do H2O2 destas (ver secção I.1.2.C. “Determinação da constante de velocidade de consumo de H2O2 em células RPE
expressam a proteína de fusão TBCCD1-GFP”).
irme uma diferença, estatisticamente significativa, entre a constante de velocidade pelo catalase destas células com o respectivos controlos, dever determinar a actividade deste enzima para as linhas celulares RPE-1 TBCCD1
expressam diferentes níveis de TBCCD1-GFP. Este estudo permitirá validar a relação entre o TBCCD1 e o metabolismo do H2O2.
O glutationo peroxidase é outro enzima igualmente responsável pela rápida metabolização do
et al, 2009). Assim, será interessante determinar a constante de
2O2 por este enzima pois poderá dar mais informações do possível papel do TBCCD1 na regulação da remoção do H2O2 da célula.
Como referido na introdução do presente trabalho, o gradiente de H2O2 através da membrana plasmática é definido com a razão entre a soma das actividades dos enzimas que consomem o , em células permeabilizadas, e o seu consumo em células intactas. A sua determinação r a concentração de H2O2 em estado estacionário no interior da célula (Antunes & Cadenas, 2000). Seria analogamente interessante determinar o gradiente de H nas linhas celulares que sobre-expressam a proteína de fusão TBCCD1-GFP, assim como para
pelo catalase em células RPE-1 de 0,25×106 células,
permeabilizadas com 1 mg/mL de digitionina, foi seguido ao longo do tempo. A constante de velocidade deste é obtida através do declive da recta ajustada aos pontos experimentais. Em A encontram-se representadas a média e o respectivo desvio padrão dos valores obtidos em 3 experiências
A possibilidade de o TBCCD1 poder influenciar a actividade do enzima catalase, isto é, o , apoia o facto de parecer existir uma relação entre os níveis de proteína essam a proteína de fusão destas (ver secção I.1.2.C. em células RPE-1 que sobre-
irme uma diferença, estatisticamente significativa, entre a constante de velocidade pelo catalase destas células com o respectivos controlos, dever-se-á 1 TBCCD1-GFP Clone 10 e GFP. Este estudo permitirá
O glutationo peroxidase é outro enzima igualmente responsável pela rápida metabolização do , 2009). Assim, será interessante determinar a constante de por este enzima pois poderá dar mais informações do possível
através da membrana plasmática é definido com a razão entre a soma das actividades dos enzimas que consomem o , em células permeabilizadas, e o seu consumo em células intactas. A sua determinação em estado estacionário no interior da célula (Antunes & Cadenas, 2000). Seria analogamente interessante determinar o gradiente de H2O2 GFP, assim como para
respectivo controlo (células RPE concentração efectiva de H2O