Na Figura 9 A são apresentados os resultados para a massa e em B e C as medidas morfométricas, respectivamente. O gráfico A mostra aumento significativo da massa das hemimandíbulas na G1 comparado com o grupo controle, entretanto houve redução significativa na massa das hemimandíbulas na G5 em relação ao controle. Entre as gerações, ocorreu redução no peso das hemimandíbulas na G3 e G5 quando comparado com a G1.
Em B são mostradas as medidas morfométricas que sofreram redução significativa nas G1, 3 e 5 quando comparadas com o grupo controle e em C, as medidas morfométricas que apresentaram um aumento na G3 quando comparada com o grupo controle.
Figura 9 - Massa e morfometria das hemimandíbulas dos ratos Wistar consanguíneos após a redução da ninhada
Média ± desvio padrão da massa das hemimandíbulas (A) e das medidas morfométricas (B e C). Para a figura 9 A: (*) indica diferença significativa (p<0,05) comparado com o controle e, as linhas acima das barras a diferença significativa quando comparado entre as gerações. Em B e C as linhas tracejadas indicam diferenças significativas conforme já descrito no texto.
7 DISCUSSÃO
Já é conhecido que a hiperalimentação causada pela redução do número de filhotes induz a obesidade e que tal estratégia é chamada de programação metabólica. Neste modelo, a obesidade é desenvolvida pelo maior aporte de leite aos filhotes durante a lactação, representando o alto consumo energético semelhante ao que ocorre nos humanos. São reportados na literatura vários trabalhos que reproduzem o quadro de instalação de obesidade em ratos por redução da ninhada (CAI et al., 2016; FISCHER et al., 2015; HABBOUT et al., 2013; HAMDY; PORRAMATIKUL; AL- OZAIRI, 2006; PLAGEMANN et al., 1992; RODRIGUES et al., 2007; SRINIVASAN, 2003; THOLE et al., 2012).
Semelhantemente aos resultados obtidos por Hamdy e colaboradores (2006), nas ninhadas reduzidas de nosso trabalho, observamos características que confirmam a obtenção do fenótipo de obesidade, ou seja, um aumento significativo da massa corporal, da gordura retroperitoneal, do Índice de Lee (índice de obesidade) e do consumo de ração na G5.
Entretanto, diferentemente dos demais trabalhos já descritos, em nosso estudo tais parâmetros foram mantidos significativamente altos nas demais gerações produzidas a partir do cruzamento consanguíneo, indicando a permanência, ao longo das gerações, das características fenotípicas de obesidade encontradas na primeira geração (G1) quando comparadas com o grupo proveniente de cruzamento não consanguíneo e sem redução de ninhada.
É sugerido que o maior depósito de gordura, que os animais provenientes de ninhadas reduzidas apresentaram, esteja relacionado ao aumento na atividade de enzimas lipogênicas nos adipócitos (MOZES et al., 2004). Velkoska e colaboradores (2005) demonstraram que animais com 120 dias superalimentados após o nascimento, apresentam aumento no RNAm da enzima 11 ß-hidroxiesteroide desidrogenase 1 (11 ß-HSD1) nas células adiposas. Esta enzima converte corticosterona em cortisol, que aumenta a lipogênese, principalmente, em adipócitos abdominais (LIVINGSTONE; KENYON; WALKER, 2000).
Os perfis elevados da massa corporal, do IL e da adiposidade retroperitoneal permaneceram presentes ao longo das cinco gerações em estudo, demonstrando que as influências no período pós-natal, principalmente da disponibilidade aumentada do
alimento no período de lactação, parecem estar ligadas a alterações permanentes no organismo observado no animal adulto, e entram em concordância com observações já realizadas em outros trabalhos em relação ao aumento na massa corporal, alterações no metabolismo e nas funções endócrinas (DE MOURA; LISBOA; PASSOS, 2008; FAUST; JOHNSON; HIRSCH, 1980; MCMILLEN; ADAM; MÜHLHÄUSLER, 2005; PLAGEMANN et al., 1992; RODRIGUES et al., 2009).
Entretanto, além de serem mantidos na vida adulta podemos acrescentar, a partir dos resultados obtidos neste trabalho, que podem ser perpetuados por gerações futuras, possivelmente por mecanismos epigenéticos, os quais foram inferidos a partir das análises morfométricas da hemimandíbulas.
Já está bem descrito na literatura que animais supernutridos, por redução de ninhada durante a lactação, sofrem mudanças metabólicas as quais acarretam alterações na homeostase lipidíca (PLAGEMANN et al., 1999; PLAGEMANN et al., 1992). Em nossos resultados, os animais consanguíneos oriundos de ninhadas reduzidas apresentaram aumento dos níveis de LDL na primeira geração, com redução gradativa, sendo que na terceira geração ainda apresentou aumento significativo e na 5ª geração semelhantes ao grupo controle (sem diferença significativa).
Contrariamente aos níveis de LDL, uma redução dos níveis de HDL foram detectados em todas as gerações estudas em relação ao controle, ocorrendo um aumento na geração 5 em relação as demais gerações estudadas. Portanto, os resultados a partir da primeira geração são concordantes com os já descritos na literatura para LDL e HDL. A diminuição nos níveis de HDL indicicam que ocorreram alterações significativas do metabolismo lipídico de forma permanentes e crescentes ao longo das gerações consanguíneas.
As alterações encontradas nos níveis das lipoproteinas LDL e HDL sugerem um quadro de dislipidemia (HDL reduzido isoladamente ou acompanhado do aumento de LDL), sendo esta uma das quatro mais relevantes classificações das alterações do perfil lipídico conforme as Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias de 2017. O acúmulo de ácido graxo livre, na forma de LDL, leva a uma série de alterações em tecidos não lipídicos (músculo esquelético, fígado e pâncreas) e promove
modificações na ação e na dinâmica da insulina (FONTES, 2003; MANCO; CALVANI; MINGRONE, 2004), que culminam com um quadro dislipidêmico.
Em relação ao colesterol total, triglicerídeos e VLDL, nossos resultados mostraram uma redução para esses parâmetros nas gerações estudadas, quando comparadas com o grupo controle. Conforme reportado por Boullu-Ciocca e colaboradores (2008), em estudos animais, a hiperalimentação por redução da ninhada induziu a obesidade precoce e acelerou a maturação do eixo hipotálamo- hipófise-adrenal (HPA), juntamente com uma regulação positiva do RNAm do receptor de glicocorticóide do tecido adiposo, o que nos permite sugerir que o fato de não observarmos o aumento de níveis de triglicérideos e colesterol pode estar relacionada ao processo de lipogênese, ou seja, os ácidos graxos livres na circulação são direcionados ao processo de armazenamento na forma de triacilgliceróis no tecido adiposo. Nossos resultados, são similares aos descritos por Rodrigues e colaboradores (2007), que demonstrou uma redução dos níveis de colesterol e triglicerídeos entre animais supernutridos comparado com o grupo controle.
Entre as várias alterações metabólicas que ocorrem no estado de obesidade severa está a variação nos níveis de glicose, cuja regulação envolve, em uma condição normal de homeostase, isto é, sem considerar uma condição de obesidade, a sensibilidade a insulina. Em condição de obesidade os níveis de glicose é um dos vários fatores que predizem a instalação da condição de obesidade ou obesidade severa resultando em síndrome metabólica. Entretanto, além da insulina outros fatores neuroendócrinos podem estar envolvidos na regulação dos níveis de glicose e ainda precisam ser completamente entendidos.
Resultados mostram que os níveis de glicose em jejum, de animais provenientes de ninhadas reduzidas sofrem aumento glicêmico sendo acompanhado de hiperinsulinemia (AALINKEEL et al., 1999; PATEL; SRINIVASAN, 2011; RINALDI et al., 2012), o que mostra alterações na regulação tanto do sequestro da glicose para o fígado e músculo mas também uma possível relação com a regulação do metabolismo lipídico.
Em nosso trabalho, os níveis de glicose, não foram obtidos em estado de jejum e se mostraram reduzidos ao longo das gerações obtidas 1, 3 e 5, quando comparados com o controle, e apenas a geração 5 teve uma redução significativa da
glicose quando comparada com o grupo controle. Entretanto, em uma condição de obesidade e síndrome metabólica severa seria de se esperar que ocorresse um aumento da glicose refletindo alguma insensibilidade à insulina.
Nos nossos resultados, onde os animais não foram submetidos a um jejum prévio, a redução dos níveis de glicose pode refletir um funcionamento normal da insulina, e apesar dos demais parâmetros avaliados estarem de acordo com uma condição de obesidade. Outra observação importante é a de que ao se olhar os níveis de glicose dos animais controles essa se apresenta alta e por si só poderia indicar que os animais controles já poderiam estar em uma condição de obesidade, entretanto, é preciso considerar que os animais gerados por acasalamento e redução de ninhada não apresentam glicose aumentada como os controles, o que indica que alguma alteração na regulação pode estar ocorrendo nos animais de cada geração sendo necessário que essa observação seja melhor investigada em gerações futuras.
Por outro lado, em outros modelos de indução de obesidade por dietas de cafeteria ou hiperlipídicas os resultados para a glicemia de jejum se mostram diversificados. Usando dieta de cafeteria, no final de 8 semanas (COATMELLEC- TAGLIONI et al., 2000), 12 semanas (NADERALI et al., 2001) ou 15 semanas e ainda, 48 semanas de dieta hiperlipídica (DUARTE et al., 2006) as taxas de glicose sanguínea em jejum não foram alteradas.
É descrito também que na obesidade, dependendo do modelo experimental utilizado, há uma alteração do tipo de microbiota encontrado no intestino e que o epitélio intestinal fornece uma proteção para a exarcebação da obesidade e suas co- morbidades associadas. Tal proteção advém da produção de mucinas pelas células caliciformes presentes no epitélio intestinal. Dessa forma, em nosso experimento, fizemos a avaliação da quantidade de células caliciformes além da medida do comprimento do intestino. Um aumento no tamanho do intestino já foi descrito por Hamaoka (1986). O autor verificou um aumento proliferativo do epitelio intestinal em camundongos obesos tratados com glutamato monossódico. Em nossos resultados também foi demonstrado um aumento do comprimento do intestino ao longo das gerações comparado com o controle, indicando uma concordância com os resultados de Hamaoka.
Já é descrito que as mucinas produzidas pelas células caliciformes tem um importante papel na proteção do epitélio intestinal contra à entrada de toxinas da microbiota que podem exarcerbar o processo inflamatório induzido pela obesidade, sendo sua avaliação um preditor na funcionalidade do intestino no processo de obesidade. Em nossos resultados, a diminuição do número de células caliciformes, detectadas pelo uso das colorações de Alcian blue (AB) e Ácido periódico de Schiff, (PAS) respectivamente, interferem na produção de mucinas ácidas e neutras e nas suas respectivas funções de proteção na condição de obesidade.
Assim, nossos resultados mostraram uma diminuição significativa das células caliciformes na geração 5 comparada com o grupo controle, indicando que a obesidade interfere significativamente na produção de mucinas no epitélio intestinal em uma condição de obesidade. Nossos resultados, apesar de preliminares, podem indicar que o cruzamento consanguíneo associado à redução da ninhada, influencia nos processos de proliferação e diferençiação do epitélio intestinal, reduzindo o número de células caliciformes e portanto, a proteção, em uma condição de obesidade ao longo das gerações.
Adicionalmente, estudos sobre a associação entre obesidade e massa óssea são relativamente comuns na literatura especialmente com foco em fêmeas e relacionando obesidade e osteoporose, porém, apresentam resultados controvérsos e de conclusões relativas. Além disso, poucos estudos existem sobre o impacto da obesidade experimental no desenvolvimento e formação dos tecidos mineralizados. No experimento realizado por Chen e colaboradores (2010), onde a obesidade foi induzida por dietas hiperlipídicas, em ratos, houve uma diminuição da massa óssea da tíbia. Os autores sugerem que essa redução da estrutura óssea observada pode ser uma ação da relação entre obesidade e fatores pró inflamatórios produzidos pelos macrófagos e osteoclastos que induzem uma reabsorção ossea.
Nos nossos resultados, a massa das mandíbulas mostrou-se maior na G1 em relação ao controle porém sofreu redução em G3 e G5 comparada com G1, o que indica uma possível ação do cruzamento consanguíneo associado a redução das ninhadas, com interferencia direta no processo de formação e remodelação da matriz óssea da mandíbula ao longo das gerações. A deposição e remodelação da matriz ossea parece se apresentar como uma característica com algum grau de flutuação ao longo das gerações, possivelmente refletindo função da atividade tanto de osteblastos
quanto de osteoclastos. Um estudo mais detalhado do processo de formação óssea é necessário para se avaliar melhor o processo de remodelação ao longo das gerações. Os resultados da massa mandibular reduzidos em G3 e G5 se refletem na redução significativa das medidas de comprimento Cr-Iia e Co-lia e de altura da região anterior das hemimandíbulas, observadas quando se compara as gerações estudadas com o grupo controle. Da mesma forma, a análise dos aumentos observados nas medidas Cr-Got, Co-Got e Go-Iia em G3 e G5, comparado com o grupo controle, embora com algumas variações, sugerem que o cruzamento consanguíneo associado a redução de ninhadas, alterou as dimensões e o tamanho das hemimandíbulas.
A avaliação da morfologia e morfometria da mandíbula é descrita na literatura, (ANDERSON; RENAUD; RAYFIELD, 2014; BURGIO et al., 2012; MARTINEZ, 2014; NAVARRO; MAGA, 2016) como marcadores de possíveis alterações epigenéticas. A mandíbula é dividida em duas regiões, uma anterior e uma posterior e podemos sugerir, a partir de nossos resultados, que ocorreu uma redução das dimensões que determinam a região anterior e um aumento nas dimensões que determinam a região posterior das hemimandíbulas, ao longo das gerações estudadas.
Uma possível explicação para a alteração das dimensões das mandíbulas, especialmente na região posterior, é que além das influências exercidas pelas alterações epigenéticas, possivelmente o aumento do processo mastigatório promovido pela musculatura associado ao processo angular, o qual é justificado pelo maior consumo de alimentos nos animais obesos. Entretanto, nas próximas gerações uma melhor avaliação da estrutura muscular associada as mandíbulas serão realizadas para confirmar essa sugestão.
Além disso, conforme Burgio (2012) as alterações morfológicas da mandíbula ocorrem com uma possível modularidade genética devido a fatores epigenéticos o que pode ser aplicado neste experimento indicando que a obesidade induzida pela redução da ninhada associada ao cruzamento consanguíneo possa ter influenciado epigeneticamente as alterações morfométricas encontradas nas hemimandíbulas dos ratos desse estudos.
Os resultados preliminares obtidos nessas 5 gerações estudadas, como o aumento nos valores do consumo alimentar, dos índices biométricos e bioquímicos, os quais são indicadores do estado de obesidade e as alterações morfométricas do
intestino e das hemimandíbulas, nos sugerem uma associação positiva entre o cruzamento consanguíneo com a redução do número de filhotes; a partir da G6, outras análises e controles serão introduzidas na busca da consolidação de uma nova linhagem de ratos obesos (fruto de 20 gerações) que possam ser disponibilizados para os pesquisadores do tema obesidade, trazendo inúmeros benefícios para a pesquisa, como a redução do número de animais e consequentemente de recursos utilizados para o estudo desta doença.
8 CONCLUSÕES ESPECÍFICAS
A associação da redução do número de filhotes com o acasalamento consanguíneo promoveu:
1) Aumento nos valores dos índices biométricos e gordura retroperitoneal. 2) Alterações no perfil sérico lipídios e glicemia.
3) Aumento no comprimento do intestino e redução na produção de mucinas na região do jejuno.
9 CONCLUSÃO
Conclui-se, pelos resultados obtidos neste trabalho, que a estratégia de acasalamento consanguíneo a partir da redução do número de filhotes pode gerar uma linhagem com características fenotípicas de obesidade.
REFERÊNCIAS
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