Depois de concluída a execução, analise os dados de acordo com o seguinte procedimento.
Definições de análise do software
1. Abra o ficheiro apropriado, utilizando o software Rotor-Gene Q, versão série 2.0.2 ou superior.
2. Certifique-se de que as amostras estão etiquetadas.
3. Quando estiver na página que mostra os dados não específicos de cada detector/canal, clique em “Options” (Opções) e introduza Crop
start cycles (Eliminar ciclos de início). Na página com “Remove data
before cycle” (Eliminar dados antes do ciclo), introduza 15 e clique em “OK”.
4. Clique em “Analyse” (Análise). Na página de análise, clique em “Cycling A (from 15), Yellow” (Ciclagem A (desde 15), Amarelo) para visualizar o canal HEX.
5. Certifique-se de que “dynamic tube” (tubo dinâmico) está em destaque. Clique em “Slope correct” (Declive correcto) e “Linear scale” (Escala linear).
6. Defina o limiar em 0,02 e verifique os valores de CT de HEX.
7. Na página de análise, clique em “Cycling A (from 15), Green” (Ciclagem A (desde 15), Verde) para visualizar o canal FAM. 8. Certifique-se de que “dynamic tube” (tubo dinâmico) está em
destaque. Clique em “Slope correct” (Declive correcto) e “Linear scale” (Escala linear).
9. Defina o limiar em 0,075 e verifique os valores de CT de FAM.
Executar análise de controlo:
Consulte o diagrama “Execução de análise de controlo” na Figura 15.
Controlo negativo: Para garantir que não existe contaminação de modelo, o controlo sem modelo (NTC) não deve gerar um valor CT no
canal verde (FAM) abaixo de 40. Consulte “Notas de interpretação de dados” na página 40 para informações importantes sobre a análise de traçados gráficos de controlos sem modelo (NTC). Para garantir que a execução foi configurada correctamente, o controlo sem modelo (NTC) deve apresentar uma amplificação do CT de 31 a 37 no canal amarelo
(HEX).
Se houver amplificação positiva no canal verde e/ou amplificação fora do intervalo 31 a 37 no sinal amarelo, os resultados da amostra devem ser eliminados.
Controlo positivo: O controlo positivo (PC) EGFR tem de apresentar um CT de ensaio de controlo entre 26,26 e 30,95 no canal verde. Um ensaio
com um valor CT fora deste intervalo indica um problema de configuração
do ensaio e a execução deve ser considerada como falhada. Se o CT do
ensaio de controlo positivo se encontrar entre 26,26 e 30,95 (exão 2, FAM), mas o CT (HEX) do controlo interno se encontrar fora de intervalo
31 a 37, continue com a análise.
Calcule conforme se segue o valor ∆CT de cada ensaio de mutação,
certificando-se de que os valores CT de mutação e de controlo são do controlo
positivo.
∆CT = CT da mutação – CT do controlo
Os valores ∆CT do controlo positivo (PC) EGFR devem ficar dentro dos valores
indicados no Quadro 7.
Quadro 7. Valores ∆CT previstos para o controlo positivo*
Ensaio Valor ∆CT do controlo positivo
T790M – 2,88 a 3,01 Delecções – 6,71 a 4,16 L858R – 2,41 a 0,90 L861Q – 4,61 a 1,48 G719X – 2,89 a 1,03 S768I – 3,37 a 2,31 Inserções – 2,93 a 1,28 * Software Rotor-Gene Q (2.0.2)
Nota: Os dados de amostra não deverão ser utilizados se qualquer um dos controlos de execução (negativo ou positivo) falhar.
Figura 15. Fluxo de trabalho de execução de análise de controlo.
Análise de amostras:
Valor CT de FAM de controlo da amostra
Desde que ambos os controlos de execução sejam válidos, o valor CT de cada
controlo da amostra deverá encontrar-se dentro do intervalo de 23 a 30,69 no canal verde. Consulte o diagrama “Análise da amostra” na Figura 16.
CT do ensaio de controlo de amostras < 23: As amostras com um CT
de controlo < 23 irão sobrecarregar os ensaios de mutação e devem ser diluídas. Para detectar cada mutação a um nível baixo, as amostras sobreconcentradas devem ser diluídas para ficarem dentro do intervalo indicado acima, utilizando o princípio de que diluindo para metade aumentará o CT em 1.
CT do ensaio de controlo de amostras no intervalo de 30,69 a 37:
Interprete com cuidado, uma vez que mutações de nível muito baixo poderão não ser detectadas.
Valor CT de FAM de Controlo Negativo O CT de FAM é < 40? SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO Verifique a Interpretação de dados na página 35 para quaisquer condições de atenuação da execução Sem atenuações Condições de atenuação da execução O CT de HEX está no intervalo de 31,00 a 37,00? Controlo negativo aprovado FALHA DE EXECUÇÃO FALHA DE EXECUÇÃO FALHA DE EXECUÇÃO SIM FALHA DE EXECUÇÃO Valor ΔCT/valor CT de FAM de Controlo Positivo O ΔCT de FAM do tubo de L858R está no intervalo de -2,41 a 0,90? O ΔCT de FAM do tubo de L861Q está no intervalo de -4,61 a 1,48? O ΔCT de FAM do tubo de T790M está no intervalo de -2,88 a 3,01? O ΔCT de FAM do tubo de Delecções está no intervalo de -6,71 a 4,16? O CT de FAM do tubo de controlo está no intervalo de 26,26 a 30,95? O ΔCT de FAM do tubo de G719X está no intervalo de -2,89 a 1,03? O ΔCT de FAM do
tubo de S768I está no intervalo de -3,37 a 2,31? FALHA DE EXECUÇÃO Controlo positivo aprovado O ΔCT de FAM do tubo de Inserções está no intervalo de -2,93 a 1,28?
Prosseguir para análise de amostra
CT do ensaio de controlo de amostras no intervalo de 37 a 40:
Interprete com cuidado, uma vez que apenas as mutações de nível muito elevado serão detectadas.
CT do ensaio de controlo de amostras > 40: A amostra não contém
ADN suficiente para permitir uma análise.
Nota: Se o valor CT de FAM da amostra se encontrar entre 23 e < 37, não há
necessidade de avaliar o controlo interno.
Nota: Se uma amostra não gerar um CT (ou seja, CT > 40), poderá ser devido
à presença de um inibidor, um erro na configuração do ensaio ou não existe ADN de EGFR amplificável.
Valor de CT do controlo interno de 31 a 37: O ensaio está a funcionar
correctamente, mas não existe ADN de EGFR amplificável.
Valor de CT do controlo interno não está dentro do intervalo de 31
a 37: Isto poderá indicar um erro de configuração do ensaio ou a
presença de um inibidor. É possível reduzir o efeito de um inibidor diluindo a amostra, embora isto também dilua o ADN.
Nota: Se a reacção FAM do ensaio de mutação não gerar um valor CT e as
reacções do controlo interno gerarem um valor CT fora do intervalo de 31 a
37, os dados devem ser eliminados, pois poderão estar presentes inibidores que poderiam originar resultados falsos-negativos. A diluição da amostra pode reduzir o efeito dos inibidores, mas tenha em atenção que a mesma também diluiria o ADN.
Figura 16. Diagrama de análise de mutação. A amostra necessita de diluição Amostra diluída O CT de FAM do ensaio de controlo está no intervalo de 23,00 a 30,69? SIM SIM SIM JA SIM NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO SIM Valor CT de FAM de controlo da amostra Valores CT de FAM de ensaios de mutação de amostra O CT de FAM é < 23,00? O CT de FAM de
cada mutação está no intervalo de 00,00 a 40,00?
Valores CT de HEX de ensaios
de mutação de controlo interno da amostra É necessário cuidado na interpretação de resultados de mutação O CT de FAM está no intervalo de 30,69 a 37,00? O CT de FAM está no intervalo de 37,00 a 40,00?
A amostra poderá não conter ADN amplificável ou poderá
conter um inibidor.
SIM
O tubo tem amplificação FAM positiva
O valor de CT de HEX
de mutação de controlo interno está
entre 31 e 37?
Amostra inválida Mutação não detectada
Calcular os valores de ΔCT do
CT de cada mutação = CT da
mutação – CT do controlo
Comparar os valores de ΔCT aos valores de
cut-off por mutação Consultar Quadro 8 do manual, página
40
Existe algum valor ΔCT
dentro do intervalo de ΔCT
especificado para o ensaio?
Mutação não detectada
Mutação EGFR detectada para o ensaio de mutação
Valor CT de FAM de ensaios de mutação de amostra
Os valores FAM de todas as sete misturas de reacção de mutação deverão ser comparados aos valores apresentados no Quadro 8.
Quadro 8. Valores aceitáveis de reacção de mutação de amostra (FAM)* Ensaio Intervalo CT aceitável Valor ∆CT de cut-off
T790M 15,00–40,00 6,38 Delecções 15,00–40,00 9,06 L858R 15,00–40,00 8,58 L861Q 15,00–40,00 9,26 G719X 15,00–40,00 9,31 S768I 15,00–40,00 9,26 Inserções 15,00–40,00 7,91
* Os valores aceitáveis estão dentro e incluem os valores apresentados.
Se o CT do FAM ficar dentro do intervalo especificado de 15,00 a 40,00, é
observada amplificação FAM positiva.
Se o CT do FAM ficar acima do intervalo especificado ou não ocorrer
amplificação, é observada amplificação FAM negativa.
Calcule conforme se segue o valor ∆CT de cada amostra de mutação que
apresente amplificação positiva, certificando-se de que os valores CT de
mutação e de controlo são da mesma amostra.
∆CT = CT da mutação – CT do controlo
Compare o valor ∆CT da amostra com o ponto de cut-off do ensaio em
questão (Quadro 8), certificando-se de que o ponto de cut-off correcto é aplicado a cada ensaio.
O ponto de cut-off é o ponto acima do qual poderá potencialmente estar um sinal positivo devido a um sinal de fundo do iniciador ARMS no ADN de tipo selvagem. Se o valor ∆CT da amostra for superior ao ponto de cut-off, é
classificado como “mutation not detected” (mutação não detectada) ou para além dos limites de detecção do kit. Se o valor da amostra for inferior ao ponto de cut-off, a amostra é considerada positiva para uma mutação detectada por esse ensaio.
Nota: Para as amostras que não apresentam CT de mutação FAM, é
necessária uma avaliação do CT (HEX) do controlo interno para determinar se
a mutação não é detectada ou se o ensaio é inválido. Se o valor do CT HEX se
encontrar entre 31 e 37, nesse caso a mutação não é detectada. Se o valor do CT HEX se encontrar fora do intervalo de 31 a 37, nesse caso a amostra é
inválida.
Em resumo, para cada amostra, será atribuído a cada reacção de mutação um estado de mutação detectada, de mutação não detectada ou de inválido,
utilizando os critérios indicados a seguir.
Mutação detectada: A amplificação FAM positiva e o ∆CT são iguais ou
inferiores ao valor de cut-off. Se forem detectadas várias mutações, podem ser reportadas todas.
Mutação não detectada:
A amplificação FAM positiva e o ∆CT são superiores ao valor de cut-off.
Amplificação FAM negativa e amplificação HEX (controlo interno) positiva.
Inválido:
Amplificação FAM negativa e amplificação HEX fora das especificações. Notas de interpretação de dados
Amplificação linear
Os traçados gráficos do Rotor-Gene Q de todas as reacções devem ser verificados. Por vezes, detecta-se um aumento no sinal de fluorescência no controlo sem modelo (NTC) e nas amostras negativas. Se for este o caso, e se for obtido um valor CT, é necessário que o utilizador distinga entre um evento
de amplificação real, que poderá indicar que há contaminação no NTC, e um aumento linear da fluorescência, que poderá ter aumentado devido a um artefacto de fluorescência.
Análise do NTC
As figuras 17 e 18 apresentam dois exemplos do comportamento de amostras de NTCs. Na Figura 17, é observado um comportamento não linear
(amplificação real) devido a contaminação de amostra. Esta execução deve ser eliminada e as amostras devem ser testadas de novo. Na Figura 18, é
observada uma amplificação linear num NTC. Nestas circunstâncias, os dados não específicos da fluorescência devem ser examinados. O traçado gráfico correspondente dos dados não específicos da fluorescência está apresentado na Figura 19, indicando um aumento linear na fluorescência, em vez de um evento de amplificação real. Os dados desta execução podem ser utilizados, desde que os controlos positivos e internos tenham passado. Para a
comparação com a Figura 19, a Figura 20 apresenta os dados não específicos da fluorescência onde ocorreu amplificação real. Nestas circunstâncias, os dados devem ser eliminados e as amostras novamente testadas, pois isto indica a presença de contaminação.
Figura 17. Contaminação num NTC de um ensaio numa execução analisada.
Amplificação a mostrar a contaminação num tubo de NTC
Figura 18. Exemplo de um aumento linear da fluorescência num poço de NTC.
Figura 19. Fluorescência não específica da Figura 18.
Aumento linear da fluorescência num poço de NTC
Amplificação linear num poço de NTC da
fluorescência não específica
Figura 20. Dados não específicos da fluorescência, apresentando um poço de NTC com um evento de amplificação real.
Análise de amostras
As figuras 21 e 22 apresentam dois exemplos de amplificação em reacções de amostras. Na Figura 21, vê-se um exemplo de amplificação real num poço de amostra numa execução analisada. Se uma execução apresentar este tipo de curva de amplificação sigmoidal, trata-se de uma amplificação real e os dados desta execução podem ser utilizados, desde que os controlos positivos e
internos tenham passado.
Contaminação num poço de NTC da fluorescência não específica. Todos os outros poços não acusam a presença de contaminante
Traçados gráficos a mostrar a amplificação real
Na Figura 22 vê-se um exemplo de amplificação linear numa reacção de amostra. Nestas circunstâncias, os dados não específicos da fluorescência devem ser examinados. O traçado gráfico correspondente dos dados não específicos da fluorescência (Figura 23) indica que o aumento linear observado na Figura 22 corresponde a um aumento linear dos dados não específicos da fluorescência e não a uma amplificação real. Desde que as verificações de controlo positivo e interno tenham passado, os resultados de amostra destas execuções podem ser utilizados com cuidado, de maneira que a amplificação linear é designada como “sem CT”.
Figura 22. Exemplo de um aumento linear da fluorescência em dois poços de amostra. Aumento linear da fluorescência em 2 poços de amostras Traçados gráficos a mostrar a amplificação real
Figura 23. Fluorescência não específica da Figura 22.