Para analisar os padrões de produção de néctar (volume, concentração e conteúdo de açúcares) e as relações entre estes dados e a hora do dia foi realizado teste de regressão linear múltipla. E para verificar a relação entre concentração e volume do néctar foi realizado um teste de regressão linear simples (Quinn & Keough 2002).
O Teste de análise de variância (ANOVA one-way) foi utilizado para analisar o efeito dos diferentes experimentos de polinização na formação de sementes de P. tenuiflora. Para padronizar a análise, a ANOVA foi calculada a partir dos dados de sementes produzidas em seis frutos formados para cada tratamento, já que esse foi o total de frutos formados no tratamento de Polinização Cruzada Manual. Os seis frutos resultantes dos experimentos de Autopolinização Manual e Controle, utilizados na analise, foram sorteados aleatoriamente dentre o total de frutos formados, e tiveram suas sementes contadas (Shaw & Mitchell-Olds 1993; Underwood 1997).
A ANOVA (one-way) também foi aplicada para verificar o efeito da diferença no número de visitas realizadas na formação de sementes de P.
tenuiflora. E para verificar a diferença na produção de sementes dos frutos
Nesses também houve padronização dos dados de frutos produzidos (Underwood 1997; Quinn & Keough 2002).
Os dados foram testados quanto à linearidade, homogeneidade de variâncias e normalidade. Utilizou-se confiabilidade de 95% (α = 0,05) (Quinn & Keough 2002). As análises foram realizadas através do programa GraphPad
Resultados
Paliavana tenuiflora é um arbusto perene com 1–3 m de altura, com
folhas simples, pecioladas, pilosas, elípticas com borda serrada e discolor. Esta espécie apresenta inflorescências simples, terminais, unifloras, com flores robustas, axilares, bem expostas e acessíveis aos visitantes florais (Fig. 3). Em Mucugê, P tenuiflora apresenta floração com pico de produção de flores entre março e maio.
A) Atrativos e Biologia Floral
Paliavana tenuiflora abre entre uma e três flores por planta, por dia. As
flores são monoclinas, campanulares, pendentes, de cor violeta azulada, com pontos e manchas púrpuro-marrons dentro e fora da corola. Não foi detectada refletância à luz ultravioleta nas flores e nem a presença de guias de néctar UV (Fig. 4).
A corola é zigomorfa, com cinco lacíneas (Fig. 5). O cálice é fundido, com cinco sépalas verdes e persistentes no fruto. O comprimento médio da corola é de 71,31 mm (d.p. ± 4,05 mm, mín = 60 e máx = 80 mm, n = 32).
A flor possui estames sinanteros, didínamos fundidos pelas anteras, com quatro anteras com deiscência longitudinal, introrsas, biteca (Fig. 6). O ovário é súpero, gamocarpelar, pluricarpelar, plurilocular, com muitos óvulos e placentação axial. O estigma é indiviso, terminal, com superfície papilada e úmida (Fig. 7).
Paliavana tenuiflora produz frutos secos, polispérmicos, deiscentes, do
a 3 mm de comprimento, e numerosas com média de 3808,85 sementes por fruto (d.p. ± 964,96, mín = 2480 e máx = 5470, n = 7).
Nenhum odor foi percebido nos diferentes verticilos florais e não foram identificados osmóforos nas flores. Também não foram identificados guias de néctar UV.
As flores iniciam a antese com a abertura das duas lacíneas laterais, seguidas pelas duas superiores, e finalmente da inferior (Fig. 9). A antese iniciou às 11h da manhã, com duração de 18 a 20 horas. A abertura completa das flores ocorreu por volta das 06h da manhã do dia seguinte. De uma a três flores por planta abrem-se de cada vez.
Paliavana tenuiflora produziu cerca de uma a três flores por planta a
cada dia. As flores tiveram duração de cerca de seis dias, quando ocorre a abscisão da flor caso não haja polinização, se houver polinização há a abscisão da corola e o gineceu e o cálice permanecem aderidos à planta até a formação dos frutos. Durante todo este período o pólen está viável, o estigma se mantém receptivo e há produção de néctar.
As flores de P. tenuiflora mostram uma marcada hercogamia e dicogamia, com a separação espacial e temporal dos seus órgãos sexuais. Neste caso esta separação é caracterizada como protandria, já que o androceu inicia seu desenvolvimento e amadurecimento antes do gineceu.
B) Funcionalidade dos órgãos sexuais
Logo após o inicio da antese o estigma, pouco receptivo, começa a se desenvolver em direção a abertura da corola. Este crescimento parece ser mais rápido nas primeiras 24 horas após a abertura floral, a partir das 48 horas
o crescimento diminui e o estigma mantém seu comprimento máximo até a senescência da flor. O comprimento médio do estigma é 23,74 mm (d.p. ± 3,05 mm), mínimo 18 mm, na pré-antese, e máximo de 31 mm, três dias após a abertura floral (n = 27).
Até as primeiras 24 horas de duração da flor o estigma está localizado atrás das anteras, possivelmente inacessível aos visitantes florais. Após as primeiras 24 horas o estigma ultrapassa o comprimento das anteras, caracterizando a fase feminina da flor, embora esteja receptivo desde a abertura floral.
As anteras de P. tenuiflora, com deiscência longitudinal, na pré-antese estão dispostas na região anterior interna da corola. Os grãos de pólen são liberados desde o inicio da antese mostrando-se completamente viáveis ao longo de toda a vida da flor, e em todas as horas do dia.
A fase masculina da flor se caracteriza pela liberação do pólen viável logo após a antese, segue até o segundo dia de duração da flor, quando quase todo o pólen produzido já foi removido pelos visitantes florais, estes removem o pólen diretamente das anteras, quando o mesmo é liberado, ou forçam a abertura dos botões florais e/ou abrem buracos na corola em busca deste.
C) Recompensas florais
O néctar é a principal recompensa floral de P. tenuiflora. Não se observou a produção de outras recompensas florais, como óleos e resinas. O pólen disponibilizado pela flor foi coletado apenas por roubadores florais.
O néctar é produzido por cinco glândulas em volta do ovário, e este se acumula na base do tubo floral (Fig. 10). Os nectários continuam aderidos à flor mesmo depois da abscisão da corola.
As flores dessa espécie produzem grande quantidade de néctar, durante todo o período de duração dessas (Fig. 11). Após a antese, o montante de néctar produzido é baixo, e este vai aumentando com o passar do tempo. O volume médio de néctar foi 15,44 µL (d.p. ±16,33 µL, mín = 0,00 µL e máx = 71,19 µL, n = 32) e a média da concentração de açúcar foi de 22,68% (d.p. ±10,15%, mín = 0,00% e máx = 32%, n = 32). O conteúdo médio de açúcar contido no néctar calculado foi de 4,9681 mg/µL (d.p. ± 5,9661 mg/µL, mín = 0,00 mg/µL e máx = 25,7707 mg/µL, n = 32).
A produção do néctar é constante durante a vida da flor, com picos de volume, concentração e conteúdo de açúcares ao longo dos dias, até o quarto dia após a antese (cerca de 100 horas), seguido por um período de queda na produção ou de uma possível reabsorção, a partir do quinto e sexto dia de flor aberta (entre 120 e 144 horas) (Fig. 12).
As variações da concentração, volume e conteúdo de açúcar do néctar não estão relacionadas ao horário do dia (P = 0.5877, R2 = 0.0654, F = 0.6531). Contudo há um maior pico de produção de néctar entre 07h e 11h. Entretanto a concentração de açúcar varia com o volume do néctar (P < 0.0001, R2 = 0.9872, F = 1120.2693), indicando que o teor de açúcar se mantém constante.
A flor continua a produção de néctar quando este é removido. Esta reposição começa a ocorrer logo após a retirada do néctar, mas parece ser mais evidente a partir de duas horas. A retomada da produção é acompanhada
pela reposição do volume, da concentração e da manutenção do conteúdo de açúcares do néctar (Fig. 13).
D) Sistema de polinização
Os resultados dos testes de polinização são apresentados na Tab. 1 e Fig. 14. A espécie P. tenuiflora se mostrou autocompatível, na área de estudo. Porém, parece que a formação de frutos só é possível com a participação de um vetor de pólen, já que das 20 flores testadas no tratamento de autopolinização espontânea, nenhuma formou fruto.
Os resultados do teste de análise de variância (P = 0,0023; F = 6,680) revelam que há diferença significativa entre autopolinização espontânea e os demais tratamentos, entretanto não foi verificada diferença significativa em relação ao número de sementes produzidas nos frutos oriundos da autopolinização manual, da polinização cruzada manual e do controle. Apesar da média de sementes produzidas nos frutos resultantes de autopolinização manual ter sido menor do que as médias de sementes dos frutos de polinização cruzada manual e do controle.
E) Visitantes Florais
E.1) Observação dos visitantes florais
Foram observados diversos grupos de visitantes florais em P. tenuiflora, incluindo abelhas, formigas e vespas (Hymenoptera), besouros (Coleoptera), beija-flores (Trochilidae) e aranhas (Araneae). As abelhas pequenas (Trigona
spinipes e Frieseomelitta francoi), as vespas, os besouros, as formigas e uma
espécie de beija-flores são considerados roubadores ou pilhadores de recursos florais, já que estes não tocam as partes reprodutivas das flores durante suas
visitas. Já as aranhas, observadas dentro e fora da corola, parecem estar na flor esperando presas.
Dentre os visitantes florais as abelhas grandes (por exemplo, Bombus
brevivillus, Eufriesea nigroirta e Eulaema nigrita) foram os mais freqüentes de P. tenuiflora, seguidos pelas abelhas pequenas T. spinipes (irapuás) e F. francoi (Meliponinae). Os visitantes menos freqüentes observados em flores de P. tenuiflora foram os beija-flores Chlorostilbon aureoventris (Trochilinae) e Phaethornis pretrei (Phaethornithinae). As abelhas grandes foram observadas
coletando néctar nas flores, com maior freqüência no inicio da manhã entre 06h e 11h, entretanto essas visitas foram contínuas, mas com menor freqüência durante todo o dia até as 17h30. Essas abelhas voam até a entrada da flor, onde pousam nas pétalas e entram nas flores rastejando até o fundo do tubo floral, coletando o néctar acumulado neste local e tocando as estruturas reprodutivas, estigma e anteras da flor, com a região dorsal do corpo (Fig. 15).
Abelhas da espécie T. spinipes foram observadas cortando as peças florais (Fig. 16), incluindo anteras e 0pétalas. As visitas foram rápidas entre três e dez segundos, geralmente em grupos de dois a cinco indivíduos. Essas realizam vôos de reconhecimento, várias vezes ao redor das flores, antes de pousarem, geralmente na região externa da corola. As visitas dessas abelhas ocorreram durante todo o período do dia, mas com maior freqüência no período matutino.
A espécie F. francoi foi observada visitando as flores para coletar gotas de néctar escorrido dos nectários e depositado nas pétalas na abertura da corola, estas raramente entraram na flor (Fig. 17 - A). As visitas duraram de
três e cinco segundos a vários minutos, durante todo o dia. Outras abelhas da mesma espécie visitaram as flores em busca de pólen. As visitas para coleta de pólen foram mais rápidas, durando cerca de 10 a 15 segundos, e raras, as abelhas voaram em volta da flor várias vezes antes de entrarem no tubo floral, onde seguiram direto para as anteras em busca do pólen. Durante este processo as abelhas não contataram o estigma da flor (Fig. 17 - B).
As duas espécies de beija-flores observados visitando as flores, C.
aureoventris e P. pretrei tiveram comportamentos distintos nessas visitas. O
tempo de visitação desses beija-flores variou entre um e quatro segundos, e as visitas foram eventuais e ocorreram em todos os períodos do dia. A espécie P.
pretrei foi observada visitando todas as flores abertas em uma mesma planta,
esse beija-flor pairou em frente às flores e introduziu o bico no tubo floral, em busca do néctar no fundo desse tubo. Em algumas visitas essa ave adotou uma posição invertida em relação à flor, visitando com o ventre voltado para cima e o bico tocando a região inferior do tubo floral. A espécie C. aureoventris visitou as flores de forma ilícita, perfurando a base da corola (Fig. 18), por onde introduziu o bico em busca de néctar. Os besouros, assim como T. spinipes visitaram as flores em busca de partes florais e pólen (Fig. 19). As formigas e vespas foram observadas principalmente fora da flor, em busca de néctar, mesmo após a queda das pétalas, no que sobrou dos nectários.
As aranhas foram observadas dentro e fora da corola em posição de captura de presas. Esse comportamento foi observado quando aranhas, dentro da corola atacaram visitantes florais, principalmente abelhas pequenas (Fig. 20). Esse comportamento não foi observado em relação às abelhas grandes.
Apesar de terem sido observados voando em torno das flores, os morcegos não fizeram contato com as mesmas. Durante todo o período de observação nenhum visitante noturno foi observado em visita às flores.
E.2) Coleta das Abelhas visitantes florais
O período de coleta foi definido a partir dos dados de observação de visitantes florais. Dentre os visitantes florais de P. tenuiflora, observados, as abelhas foram os predominantes e mais diversos. Em virtude disso, essas foram coletadas para identificação e análise.
Foi coletado um total de 174 abelhas em 15 espécies e 10 gêneros da Família Apidae (Tab. 2 e Fig. 21). As abelhas grandes, Bombus brevivillus,
Epicharis sp., Eulaema nigrita, Euplusia sp. e Centris fuscata, foram as mais
abundantes nas flores representando aproximadamente 75% do total de visitantes coletados.
A maior freqüência de visitas e de coletas se deu entre 06h e 11h, cerca de 75% das abelhas foram coletadas nesse horário, enquanto apenas 25% das coletas foram registradas a tarde. As abelhas coletadas visitaram em média 1,56 flores (d.p. ± 0,99, mín = 1 e máx = 5) na mesma planta onde havia entre uma e três flores abertas, antes de investirem em visitas a outras plantas da mesma espécie, carregando pólen na região dorsal do corpo.
E.3) Eficiência das Abelhas Visitantes
Uma visita por abelhas grandes às flores de P. tenuiflora não foi suficiente para a formação de frutos e sementes, já que nas 14 flores observadas “uma visita” não ocorreu formação de frutos. Diferentemente das flores que receberam “duas visitas” e “três visitas” que formaram frutos.
Entretanto estas visitas resultaram na formação de poucos frutos, dois e três frutos respectivamente, em relação ao controle, em que todas as flores abertas à polinização natural formaram frutos, totalizando 14 frutos formados.
O número médio de sementes produzidas nos frutos resultantes de “duas visitas” foi de 2455 sementes e de “três visitas” foi de 2892,5 sementes. Os frutos formados no controle produziram uma média de 3330 sementes.
Entretanto, o resultado da análise de variância não mostrou diferença significativa entre a média de sementes produzidas nos frutos resultantes de “duas visitas”, “três visitas” e o controle (P = 0.4949, F = 0.8973).
E.4) Exclusão de visitantes noturnos e diurnos
As flores de P. tenuiflora não foram visitadas no período noturno, de 17h30 as 05h30. Nos testes referentes à exclusão de visitantes florais, não houve formação de frutos nas 14 flores testadas para exclusão de visitantes diurnos, abertas à noite. As flores abertas durante o dia, caracterizando a exclusão de visitantes noturnos, formaram seis frutos totalizando 43% de eficiência de visitas, para um total de 14 flores testadas. As flores do controle formaram 100% de frutos. O resultado da ANOVA mostrou diferença significativa entre os três tratamentos, P = 0.0001 e F = 17.909. Entretanto não houve diferenças entre as sementes produzidas nos experimentos de exclusão de visitantes noturnos e no controle.
Discussão
Paliavana tenuiflora, como outras espécies que ocorrem em áreas de
elevadas altitudes (Feinsinger et al. 1986; SanMartin-Gajardo & Sazima 2004), apresenta um longo período de antese, suas flores chegam a durar seis dias, período superior à média de duração das flores em vegetações de planície tropicais (Bawa 1990; Borba & Braga 2003; Conceição 2003). Essa longa vida das flores pode estar relacionada à imprevisibilidade dos “serviços” de polinização nos ambientes de altitude (Bawa 1990; Linhart et al. 1987; Sazima & Sazima 1990; SanMartin-Gajardo & Sazima 2004). Outra explicação possível estaria associada à grande produção de óvulos por flor, que para a fertilização requerem múltiplas visitas dos polinizadores às suas flores (Feinsinger et al. 1986). Essa hipótese foi de certa forma corroborada pelos nossos resultados que indicaram que apenas uma visita do polinizador não é suficiente para formação de frutos e sementes. Nessa espécie são necessárias pelo menos duas visitas para garantir o sucesso reprodutivo.
O longo período de antese e duração das flores tem sido também relacionados a espécies vegetais que apresentam características florais associadas às síndromes de ornitofilia e melitofilia, a exemplo de Zeytheria
montana Mart. (Bignoniaceae) e a Palicourea brenessi Standl. (Rubiaceae),
respectivamente. De acordo com os resultados desses estudos, essa estratégia, provavelmente, possibilita que as flores sejam eficientemente polinizadas por animais como beija-flores e abelhas, que forrageiam de forma constante em muitas flores, durante todo o período de floração (Wesselingh et
Apesar de, na maioria dos casos, ainda permanecer incerto como as características florais afetam o comportamento do polinizador, ou como a combinação dessas características se integra com os sistemas sensoriais dos animais (Galliot et al. 2006), atraindo os diversos grupos de visitantes para as flores, polinizadores ou não, há evidências de que os aspectos morfológicos dos atributos florais influenciam o processo de polinização e atração dos visitantes (Faegri & Van der Pijl 1979; Proctor et al. 1996; Barrett 1998).
Em P. tenuiflora, características da arquitetura floral, como a hercogamia associada com protandria, podem reduzir os níveis de autopolinização, tornando o sistema de polinização cruzada mais eficiente, e com isso contribuir para o aumento do fitness das plantas através de uma dispersão mais eficiente do pólen (Barrett 1998; Rivera-Marcahnd & Ackerman 2006). Nessas flores o estigma fica inacessível aos visitantes no primeiro dia após a antese, quando o pólen é liberado. Nos dias subseqüentes, o estigma supera as anteras em comprimento e fica exposto às visitas, então os visitantes florais com pólen de outras flores aderido ao corpo, podem promover o fluxo polínico entre flores diferentes.
Além de apresentar barreiras mecânicas à autopolinização, como a hercogamia, essa espécie apresenta flores isoladas, produz poucas flores por planta, com enorme investimento na produção de óvulos e na longevidade floral, com produção constante de néctar que permitem a atração de visitantes florais eficientes e especializados na transferência de pólen, e garantem a polinização cruzada e o seu sucesso reprodutivo (Ackermann & Weigend 2006).
As características florais de P. tenuiflora, como flores grandes e robustas, com corola zigomorfa, longa em forma de campânula pendente, violeta-azulada, tanto podem ser associadas a visitantes como abelhas grandes quanto a beija-flores e morcegos (Sazima et al. 1999; Buzato et al. 2000; Sanmartin-Gajardo & Sazima 2004). Esses atributos florais somados às características do néctar, como produção contínua, grande volume ofertado e concentração alta de açúcares (22,68%, ±10,15%), atraem visitantes como beija-flores e abelhas, cujos limites aceitáveis para a concentração de açúcares no néctar são de 23,9%, ± 10,6%, e de 28,7%, ± 10,6%, respectivamente. Entretanto, esses valores não correspondem a flores polinizadas por morcegos, que geralmente exibem néctar mais diluído, com média de concentração de 7,1%, ± 3,4% (Corbet & Willmer 1981; Baker et al. 1998; Perret et al. 2001; Chalcoff et al. 2006).
No caso das abelhas, que requerem concentração de açúcares mais alta, a quantidade de néctar produzido por essas flores pode ser um forte atrativo que compensaria o fato desses animais terem que realizar inúmeras visitas para suprir suas necessidades calóricas. Por outro lado, para P.
tenuiflora que necessita de muitas visitas, esta concentração de açúcar no
néctar, diluído em relação ao néctar produzido em flores melitófilas, pode favorecer o fluxo polínico realizado por abelhas grandes, que visitam as flores em trapline (Machado et al. 1998; Buzato et al. 2000; Wesselingh et al. 2000), visitando todas as flores abertas em uma planta diversas vezes antes de investirem na próxima planta.
Poucas flores abertas por dia, por planta, como ocorre em P. tenuiflora favorecem esse padrão de visitação (Sazima et al. 1999). Visitantes com esta estratégia de forrageio, como Bombus brevivillus, Ephicharis sp., E. nigrita e P.
pretrei foram observados realizando trapline em P. tenuiflora. Esses visitantes
percorrem maiores distâncias e favorecem maior fluxo polínico entre as espécies visitadas (Bawa et al. 1985b), garantindo a polinização cruzada e o sucesso reprodutivo da espécie.
As relações entre planta e polinizador podem ser mais complexas e influenciadas por outros fatores e atributos florais que não apenas as características do néctar (Perret et al. 2001; Galetto & Bernardello 1993). O néctar floral é a fonte primária de energia para os visitantes florais como insetos, aves e mamíferos (Baker et al. 1998; Corbet 2003). Os diferentes padrões de secreção do néctar podem estar relacionados aos polinizadores, as variações ambientais de temperatura e umidade, a reabsorção seletiva de solutos e água e a mudanças na concentração de açúcares (Baker et al. 1998; Corbet 2003; Galetto & Bernardello 1993; Bernardello et al. 1994; Rivera et al. 1996).
O posicionamento do néctar em câmaras na base da corola pode ser uma estratégia das flores para guiar os seus visitantes florais para o interior do tubo floral, forçando o contato com as estruturas reprodutivas, possibilitando assim, a polinização cruzada (Viana & Kleinert 2006). A arquitetura floral de P.
tenuiflora favorece essa estratégia já que suas flores são pendentes, e para
comportamento favorece o contato dos visitantes mais robustos com as estruturas reprodutivas da flor.
Algumas espécies com flores pendentes como P. tenuiflora apresentam mecanismos que evitam a perda do néctar como presença de pelos, ou néctar mais viscoso (Sazima et al. 2003), o que também pode prevenir a ação de roubadores florais (Inouye 1993). Porém P. tenuiflora não apresenta néctar viscoso nem tampouco tais estruturas que ajudam a manter o néctar na base da corola. Assim, o néctar produzido em suas flores pode escorrer até a abertura da corola tornando-se disponível para todos os visitantes florais,