Análise das sequências obtidas das amostras de DNA através da comparação

RyR2

Através dos eletroferogramas apresentados de seguida, obtidos no software

SeqScape® v.3 (Applied Biosystems®), pode observar-se a composição em nucleótidos dos fragmentos de DNA. O software SeqScape® v.3 (Applied Biosystems®) permitiu a comparação da sequência obtida, após sequenciação, com a sequência referência, previamente selecionada a partir da base de dados Ensembl, permitindo detetar e assinalar possíveis variações genéticas. No esquema de cores da leitura dos nucleótidos a base A está representada a verde; a base T a vermelho; a base C a azul e a base G a preto.

Figura 20: Exemplo de um eletroferograma, visualizado no software SeqScape® v.3

(Applied Biosystems®_{), de um fragmento de DNA extraído da zaragatoa bucal da amostra}

B4, sequenciado com o primer foward do exão 3 do gene RyR2.

Figura 21: Exemplo de um eletroferograma, visualizado no software SeqScape® v.3

(Applied Biosystems®), de um fragmento de DNA extraído da zaragatoa bucal da amostra B4, sequenciado com o primer foward do exão 93 do gene RyR2.

Figura 22: Exemplo de um eletroferograma, visualizado no software SeqScape® v.3

(Applied Biosystems®), de um fragmento de DNA extraído da zaragatoa bucal da amostra B4, sequenciado com o primer foward do exão 103 do gene RyR2.

No eletroferograma da Figura 23 pode observar-se a composição em nucleótidos dos fragmentos de DNA, obtidos no software SeqScape® v.3 (Applied Biosystems®) que permitiu a comparação das sequências obtidas, após sequenciação com os primers foward e reverse do exão 93 do gene RyR2, com a sequência referência. No esquema de cores da leitura dos nucleótidos a base A está representada a verde; a base T a vermelho; a base C a azul e a base G a preto.

Figura 23: Exemplo de um eletroferograma, visualizado no software SeqScape® v.3

(Applied Biosystems®_{), dos fragmentos de DNA extraídos da zaragatoa bucal da amostra}

A MSC pode ocorrer em todas as idades e, em geral, a doença arterial coronária e o enfarte agudo do miocárdio representam mais de 90% dos casos (Zipes and Wellens, 1998), (Eckart et al., 2011). Contudo, quando se considera a MSC em jovens (≤ 40 anos) estima-se que 30% de todas as mortes não traumáticas são causadas por uma variedade de distúrbios arritmogénicos (Germann and Perron, 2005) (Gráfico 1). Uma vez que esses distúrbios não causam qualquer alteração estrutural no coração, nenhuma causa de morte é geralmente identificada na autópsia médico-legal completa e esses casos são designados como MSI. Diversos estudos mais recentes, citados de seguida, estão em conformidade com os de Germann et al. (Germann and Perron, 2005).

Nos estudos de Kauferstein et al. foi realizada a análise genética em 15 casos de MSI de modo a detetarem mutações nos principais genes que causam canalopatias cardíacas. O teste genético revelou mutações que podem explicar a causa da morte em 4 dos 15 casos de MSI (27%) (Kauferstein et al., 2013). Também o estudo de Campuzano

et al. realizou análises genéticas, nos principais genes associados à MSC, em 29 casos de

MSI em jovens (<15 anos) (Campuzano et al., 2014). Nessa análise foram identificadas variações genéticas potencialmente patogénicas em 41% dos casos (sendo que cerca de 30% foram em genes arritmogénicos). Já Gladding et al. usaram amostras de recém- nascidos, vítimas de MSI, e identificaram variações genéticas causadoras de doença em 4 dos 19 casos (21 %) (Gladding et al., 2010). Entre 2009 e 2011, a análise genética de 15 vítimas jovens de MSI provenientes de departamentos de medicina forense da Suécia revelou que 6 das vítimas (40%) apresentavam mutações patogénicas como possível causa de MSC sendo que 2 delas (~13%) se encontravam no gene RyR2 (Stattin et al., 2016).

Admite-se que cerca de 15% dos indivíduos com MSI apresentam TVPC (Tester et al., 2012) e 60% desses casos estão relacionados com mutações autossómicas dominantes no gene RyR2. Em conformidade com isso, entre 2008 e 2014 Yu et al. realizaram um estudo em Hong Kong a fim de detetarem mutações no gene RyR2 em 10 crianças diagnosticadas com TVPC, confirmando-se mutações nesse gene em 6 delas (60%) (Yu et al., 2016). Também Roston et al. realizou um estudo em jovens (<19 anos de idade) com TVPC e nos seus familiares de primeiro grau. O teste genético foi realizado em 194 indivíduos sendo que 117 (60%) apresentava TVPC1 associada a mutações no gene RyR2 (Roston et al., 2017b).

O estudo de Medeiros-Domingo et al. aponta que 65% das mutações no gene RyR2, associadas à TVPC, podem ser detetadas pelo rastreio de 16 dos 105 exões do gene RyR2

- 3, 8, 14, 45, 46, 47, 49, 88, 89, 90, 93, 96, 97, 100, 101 e 103. (Medeiros-Domingo et al., 2009). No presente estudo foi definido que apenas se estudariam 3 destes 16 exões do gene RyR2, os exões 3, 93 e 103.

Gráfico 1: Representação gráfica onde se demonstram as percentagens de: MSC com

origem em síndromes arrítmicas; relevância da TVPC entre as síndromes arrítmicas; relação da TVPC com o gene RyR2; distribuição das mutações nos exões do gene RyR2.

Morte Súbita Cardíaca Síndromes Arrítmicas TVPC Gene RyR2

Os cálculos estatísticos deste estudo mostraram que a probabilidade de na nossa amostra de 50 indivíduos estes apresentarem, pelo menos, uma variação genética nos exões 3, 93 e 103 do gene RyR2 é de 0.3%. Esta probabilidade é reduzida, como seria de esperar, uma vez que partimos de amostras de indivíduos saudáveis e não de amostras

post-mortem de indivíduos cuja causa de morte permanece desconhecida depois de uma

autópsia médico-legal completa, incluindo a realização de exames complementares de diagnóstico (toxicológicos e histológicos), a avaliação da história clínica e a investigação das circunstâncias da morte.

Após a análise completa no grupo de amostragem deste estudo, não foi encontrada nenhuma variação genética nos exões 3, 93 e 103 do gene RyR2. Não podemos, contudo, afirmar se estes resultados se encontram ou não em conformidade com os estudos citados em bibliografia, uma vez que não há nenhum estudo publicado onde a amostragem corresponde a uma população assintomática, sem diagnóstico de TVPC nem relato de casos de MSC na família.

É ainda de realçar que o gene RyR2 não foi totalmente sequenciado, nem o rastreio dos 16 exões, recomendado por Medeiros-Domingo et al., foi realizado. De referir

30% 70% Sindromes Arrítmicas Outras causas 15% 85% Taquicardia ventricular polimófica catecolaminégica Outras Síndromes 65% 35% 16 exões Restantes exões 60% 40% Gene RyR2 Outros genes

igualmente que, o número de voluntários (n=50) é reduzido, tendo em consideração que a incidência dos indivíduos apresentarem pelo menos uma variação genética nos exões 3, 93 e 103 do gene RyR2 é de 3/1000. Desta forma, não se pode concluir que os indivíduos não apresentam TVPC associada a mutações no gene RyR2, uma vez que, para isso, ter- se-ia de fazer um rastreio mais completo.

Considerando estas limitações, e embora não fossem detetadas quaisquer variações genéticas nos exões 3, 93 e 103 do gene RyR2 das amostras analisadas, o protocolo experimental desta investigação demonstrou ter bons resultados face ao que era pretendido estudar.

Com este estudo, embora com limitações, foi possível demonstrar a possibilidade de serem realizados testes genéticos para o rastreio de síndromes arrítmicas, como a TVPC. No entanto, atualmente existem métodos como a Next Generation Sequencing (NGS) e o

Whole Exome Sequencing (WES) que serão, provavelmente, a estratégia mais eficaz para

descobrir a etiologia das síndromes arrítmicas possivelmente responsáveis pela MSC (Stattin et al., 2016).

A NGS é um método de deteção de variações genéticas rápido, barato, sensível e de alto rendimento que pode ser implementado na prática diária quotidiana em Genética Forense, proporcionando novos conhecimentos sobre fisiopatologia da MSC (Chanavat et al., 2016). Contudo, dada a enorme quantidade de informações geradas pela NGS, seria crucial uma estratégia rigorosa de filtragem das variações identificadas, juntamente com uma colaboração multidisciplinar, a fim de se determinar o seu potencial papel patogénico na causa da morte (Farrugia et al., 2015). Já a WES é uma estratégia eficiente para detetar variações genéticas, raras e potencialmente patogénicas, no exoma, e que possam estar subjacentes à causa de MSI (Neubauer et al., 2016). Porém, a possível identificação de variantes de significância desconhecida torna desafiadora a interpretação dos resultados. Apesar da atual falta de conhecimento na classificação de patogenicidade de variantes genéticas ambíguas, a identificação de variações genéticas patogénicas ou potencialmente patogénicas em casos de MSI permite a realização de avaliação clínica, aconselhamento genético e medidas preventivas de parentes em risco, com o objetivo de prevenir novos casos de MS na mesma família (Campuzano et al., 2014). Face a isso, seria bastante proveitoso que num futuro próximo se iniciassem exames genéticos de forma mais rotineira num laboratório forense, como Laboratório de Biologia e Genética Forenses do INMLCF, I.P., principalmente em casos de MSI, a fim de se estabelecer um diagnóstico

colheita e preservação de tecido cardíaco, assim como de sangue periférico, para permitir a análise genética sempre que seja admissível que a morte possa estar relacionada com alterações genéticas hereditárias com repercussões no ritmo cardíaco, tal como acontece na TVPC (Priori et al., 2016). Assim, um correto diagnóstico post-mortem poderia, nestes casos, revelar-se fundamental para os familiares da vítima, uma vez que as mutações no gene RyR2, associadas à TVPC, têm um padrão de herança autossómica dominante (Priori and Chen, 2011).

Entre 2005 e 2013 foi realizado um estudo genético no Japão em indivíduos com mutações no gene RyR2 e nos seus pais, confirmando a origem hereditária das respetivas mutações (Ohno et al., 2015). Contudo, este estudo constatou que a herança das mutações no gene RYR2 foi significativamente mais frequente nas mães (34,3%). Também o estudo de Priori et al. confirmou uma maior frequência na herança materna comparativamente com a parterna (Priori et al., 2002). No entanto, acredita-se que essa baixa frequência de herança paterna pode resultar do mau prognóstico de pacientes do sexo masculino, em comparação com mulheres (Priori et al., 2002), morrendo estes antes da idade de reprodução.

Porém, dados limitados suportam uma elevada taxa de mutações de novo no gene RyR2 (van der Werf et al., 2012a), (Kawamura et al., 2013), o que significa que nenhum dos progenitores detém a mutação genética. Numa análise de coorte japonesa de 14 indivíduos com TVPC, o teste genético resultou numa taxa de mutações de novo no gene RyR2 de 57% (Kawamura et al., 2013). Também o estudo de 15 famílias holandesas revelou variantes RyR2 de novo em quase metade dos indivíduos (van der Werf et al., 2012a). Todavia, com base nos estudos existentes, é impossível calcular a verdadeira taxa de variantes de novo devido ao rastreio parental incompleto (Roston et al., 2017b).

O rastreio parental, principalmente em parentes assintomáticos, pode fornecer resultados diagnósticos potencialmente explicativos que podem ajudar a identificar indivíduos que possam estar em risco. Foi realizado um estudo no Canadá envolvendo 96 indivíduos, familiares de primeiro grau de pacientes com paragem cardíaca ou vítimas de MSI, com fenótipo para anormalidades cardíacas (Steinberg et al., 2016). Detetaram-se mutações causadoras de doenças identificadas em 20 dos familiares testados (21%) sendo que as mutações no gene RyR2 foram das mais comuns, apresentando a TVPC uma correlação fenótipo-genótipo de 75%. Entre 1994 e 2007, após um estudo genealógico em 4 famílias com vários episódios de MSC em indivíduos jovens, 1404 indivíduos aparentados da lha da Gran Canaria (Espanha) foram sujeitos a testes genéticos a fim de

se determinar uma causa genética para esses eventos fatais (Wanguemert et al., 2015). Neste estudo identificou-se uma mutação missense no exão 13 do gene RyR2 em 185 ( ̴13%) dos indivíduos aparentados, sendo 6 destes vítimas de MSC.

Posto isto, é altamente recomendável uma avaliação interdisciplinar abrangente dos familiares em primeiro grau das vítimas MSI, uma vez que dessa forma poderá ser possível evitar outras mortes, prevenindo-se futuros eventos cardíacos fatais, através de um aconselhamento genético e de cardiologia especializados, do ajuste do estilo de vida ou iniciando tratamento farmacológico, ou outro, se disponível (Michaud et al., 2011), com vista ao tratamento de doenças cardíacas que até aí eram totalmente desconhecidas para estes pacientes.

As conclusões do presente estudo foram:

1. O protocolo para a análise dos exões 3, 93 e 103 do gene RyR2 foi padronizado e concretizado com sucesso;

2. As sequências obtidas foram estudadas em software apropriados, através da comparação com sequências de referência, não se detetando variações genéticas nos exões 3, 93 e 103 do gene RyR2 na população estudada;

3. Apesar de não serem encontradas quaisquer variações genéticas nos exões 3, 93 e 103, da população estudada, não podemos excluir o gene RyR2 como possível marcador da TVPC uma vez que não se realizou um rastreio completo de todo o gene nem de todos os exões recomendados. Além disso, a inexistência de variações nestes 3 exões não nos permite afastar a hipótese de esta população estudada vir a desenvolver TVPC;

4. A inclusão de estudos genéticos post-mortem, em casos de MSC, em indivíduos com corações estruturalmente normais é altamente recomendável.

Deste modo, consideramos ser necessário e importante a integração de estudos genéticos, para o despiste das canalopatias mais frequentes, na investigação da MSC de indivíduos jovens em Portugal. Os testes genéticos post-mortem quando realizados rotineiramente nos casos de MSI podem ter uma acuidade diagnóstica maior e os familiares em primeiro grau das vítimas podiam ser avaliados sobre o risco de possuir uma condição cardíaca fatal. Além disso, a avaliação por testes genéticos de familiares de vítimas de MSC poderia reduzir a morbilidade e a mortalidade através do envio deste indivíduos para consulta de especialidade de forma a ser monitorizada a sua função cardíaca.

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