Análise de atividade das enzimas endoglicanase, exoglicanase e glicosidase

5.18.1 Determinação de atividade sobre CMC

A atividade foi determinada por ensaio colorimétrico de detecção de açúcares redutores gerados pela hidrólise do substrato CMC. Para a detecção de açúcares redutores em solução foi utilizado o reagente DNS (Miller, 1959).

Os ensaios de atividade foram realizados nas seguintes condições: 50 μL de CMC 2% (p/v), em tampão acetato de sódio 200 mM (pH 6,0) e 50 μL de amostra contendo a enzima (sobrenadante da cultura). A mistura foi incubada a 50°C por 30- 120 minutos e em seguida adicionou-se 400 μL de reagente DNS. As amostras foram fervidas por 10 minutos e 100 μL foram diluídos em 800 μL de água e então a absorbância foi lida a 540 nm em espectrofotômetro. As leituras de absorbância foram convertidas em quantidade de equivalente de glicose, por meio da curva de calibração

obtida pela leitura da absorbância de diferentes concentrações de glicose (10 a 100 μg) com o reagente DNS (Anexo 9). Todos os ensaios foram realizados em triplicata, utilizando como branco a solução contendo 50 μL do tampão de reação e 50 μL do substrato (CMC 2%); tratados como descrito anteriormente. Como controle da concentração inicial de açúcares redutores no meio de cultivo, foi realizado também reação com 50 μL da amostra de enzima e 50 μL de tampão de reação sem o substrato CMC e submetidos ao mesmo procedimento. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para gerar 1 μmol de equivalente de glicose por minuto de reação.

5.18.2 Determinação de atividade sobre CMC em placa

Pequenas alíquotas do sobrenadante das culturas (2 μL) foram aplicados em placa de meio mínimo MD-CMC-Ágar Tamponado. Após a penetração do líquido no gel, a placa foi incubada a 30°C por 24 horas. Em seguida, foi corada com solução de

Congo Red 0,1% (p/v). As placas foram descoradas com solução NaCl 1 M por 15

minutos e a formação de halo de hidrólise no local da aplicação da amostra, foi analisada.

5.18.3 Determinação de atividade sobre pNPC

Os ensaios de atividade utilizando o substrato sintético pNPC (Sigma) foram realizados com 100 μL de pNPC 5 mM, em tampão acetato de sódio 200 mM (pH 5,5) e 100 μL de amostra contendo a enzima (sobrenadante da cultura). A mistura foi incubada a 50°C por 120 minutos e em seguida, foi adicionado 1 mL de Na2CO3 1M.

Todos os ensaios foram realizados em triplicata, utilizando como branco a solução contendo: 100 μL do tampão de reação e 100 μL do substrato (pNPC 5 mM); tratados como descrito anteriormente. O pNP liberado foi detectado lendo-se a absorbância a 405 nm. Uma unidade de atividade corresponde a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de p-nitrofenol nestas condições. Como controle, foi realizado mesmo procedimento adicionando-se água à reação, foi realizado também reação com 100 μL da amostra da enzima 100 de tampão de reação sem o substrato pNPC. As leituras de absorbância foram convertidas em quantidade de equivalente de pNP, por

meio da curva de calibração obtida pela leitura da absorbância de diferentes concentrações de pNP (Anexo 10).

5.18.4 Determinação de atividade sobre pNPG

Os ensaios de atividade utilizando o substrato sintético pNPG (Sigma), apenas qualitativo, foram realizados com 100 μL de pNPG 5 mM, em tampão Acetato de sódio 200 mM pH 5,5, e 100 μL de amostra contendo a enzima (sobrenadante da cultura ou extrato celular diluído em água para OD600 de 2). A mistura foi incubada a

50°C por 60 minutos e em seguida foi adicionado 1 mL de Na2CO3 1 M. A análise

qualitativa foi feita pela presença de cor amarelada decorrente da liberação de pNP.

5.18.5 Determinação de atividade sobre MUC

Os ensaios de atividade utilizando o substrato sintético MUC foram realizados com 100 μL de MUC 5 mM, em tampão acetato de sódio 200 mM (pH 5,5) e 100 μL do sobrenadante das culturas a serem analisadas. A mistura foi incubada a 50°C por 30 minutos e em seguida foi adicionado 1 mL de Na2CO3 1 M. As reações foram

visualizadas com luz ultravioleta, pois a degradação do substrato é observada pela emissão de fluorescência violeta. Como branco, foi realizado mesmo procedimento adicionando-se água à reação ao invés do sobrenadante da cultura.

5.18.6 Determinação de atividade sobre Sigmacel

A atividade foi determinada por ensaio colorimétrico de detecção de açúcares redutores gerados pela hidrólise da celulose microcristalina Sigmacel (Sigma). Para a detecção de açúcares redutores em solução foi utilizado o reagente DNS (Miller, 1959).

Os ensaios de atividade foram realizados nas seguintes condições: 50 μL de Sigmacel 2% (p/v), em tampão acetato de sódio 200 mM (pH 5,5) e 50 μL de amostra contendo a enzima (sobrenadante da cultura). A mistura foi incubada a 50°C por 120 minutos e em seguida adicionou-se 400 μL de reagente DNS. As amostras foram fervidas por 10 minutos e 100 μL foram diluídos em 800 μL de água e então a

convertidas em quantidade de equivalente de glicose, por meio da curva de calibração obtida pela leitura da absorbância de diferentes concentrações de glicose (10 a 100 μg) com o reagente DNS (Anexo 9). Todos os ensaios foram realizados em triplicata, utilizando como branco a solução contendo 50 μL do tampão de reação e 50 μL do substrato (Sigmacel 2%); tratados como descrito anteriormente. Como controle da concentração inicial de açúcares redutores no meio de cultivo, foi realizado também reação com 50 μL da amostra de enzima e 50 μL de tampão de reação sem o substrato Sigmacel e submetidos ao mesmo procedimento. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para gerar 1 μmol de equivalente de glicose por minuto de reação.

5.18.7 Determinação de atividade sobre papel de filtro

A atividade sobre papel de filtro foi determinada por ensaio colorimétrico de detecção de açúcares redutores gerados pela hidrólise papel filtro. Para a detecção de açúcares redutores em solução foi utilizado o reagente DNS (Miller, 1959).

Os ensaios de atividade foram realizados nas seguintes condições: 50 μL de papel de filtro (2 x 0,5 cm), em tampão acetato de sódio 200 mM (pH 5,5) e 50 μL de amostra contendo a enzima (sobrenadante da cultura). A mistura foi incubada a 50°C por 120 minutos e em seguida adicionou-se 400 μL de reagente DNS. As amostras foram fervidas por 10 minutos e 100 μL foram diluídos em 800 μL de água e então a absorbância foi lida a 540 nm em espectrofotômetro. As leituras de absorbância foram convertidas em quantidade de equivalente de glicose, por meio da curva de calibração obtida pela leitura da absorbância de diferentes concentrações de glicose (10 a 100 μg) com o reagente DNS (Anexo 9). Todos os ensaios foram realizados em triplicata, utilizando como branco a solução contendo 50 μL do tampão de reação e 50 μL do substrato (papel de filtro em tampão); tratados como descrito anteriormente. Como controle da concentração inicial de açúcares redutores no meio de cultivo, foi realizado também reação com 50 μL da amostra de enzima e 50 μL de tampão de reação sem o substrato e submetidos ao mesmo procedimento. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima necessária para gerar 1 μmol de equivalente de glicose por minuto de reação.