Análise do Processo de Pedidos de Encomendas

La femille des gènes Gai comprend des gènes structuraux et régulateurs qui permettent aux cellules d’utiliser le galactose comme source de carbone.

Parmi les gènes dits "structuraux", on retrouve en autre Gall et Gai 10, qui sont impliqués dans la pénétration et le métabolisme du galactose dans la levure par un enchaînement de réactions enzymatiques. Gal4, Gal80 et Gal3 font partie des gènes régulateurs, Gal4 étant responsable de l’activation de la transcription des gènes structuraux et Gal80 son inhibiteur (il se lie à Gal4 lorsque les sources de carbone présentes sont autres que le galactose) (Lohr et al. 1995). La protéine Gal3 se fixe, quant à elle, sur Gal80 en présence de galactose et d’ATP, permettant ansi au domaine activateur de Gal4 d’être démasqué et de jouer son rôle (Yano et al. 1997).

Sur les 881 acides aminés que compte la protéine Gal4, seuls les 147 premiers sont importants pour la liaison à l’ADN et la dimérisation du fecteur. Ce domaine possède également un motif "Zinc Finger" de type Zn2Cys6 (Angrand 1993) (fig. 6) ainsi qu’un signal de localisation nucléaire (Lohr et al. 1995).

Les UASg ("upstream activating sequence") sont les séquences d’ADN qui médient l’induction galactose de l’expression, en servant de site de liaison à la protéine GA14 qui s’y lie sous forme de dimère. L’élément promoteur Gai majoritaire est ime séquence de 17 paires de bases, de symétrie partielle (Kang et al. 1993), présente en plusieurs exemplaires, en amont du gène (4 séquences au niveau des promoteurs Gall et 10).

Fig.7 : Principe de la méthode "double-hybride".

Les plasmides 1 et 2 introduits dans la levure et sélectionnables par croissance sur un milieu dépiété en certains acides aminés, permettent l'expression respectivement d'une protéine de fusion "domaine de liaison à l'ADN de Gal4 (DLA)-protéine d'intérêt" et d'une protéine de fusion "domaine activateur de Gal4 (DA)- protéine obtenue au départ d'une banque d'ADNc".

Lorsque les deux protéines de fusions sont capables d'interagir, le complexe obtenu permet l'activation d'un ou plusieurs gènes rapporteurs.

Les acides aminés 768 à 881 constituent le domaine activateur de la protéine Gal4. Parmi ceux-ci, les résidus 856 à 869 semblent former une structure en feuillet P anti- parallèle avec un site d’interaction pour la protéine Gal80 sur une face du feuillet et la fonction d‘activation de la transcription sur l’autre. Actuellement, on pense qu’il n’existe pas de structure définie pour im domaine activateur de la transcription mais plutôt que cette activité requiert la présence de résidus acides (Sigler 1988). Cependant, il est intéressant de constater que les résidus acides contenus dans la région C-terminale de la protéine GA14 ne jouent pas de rôle important dans l’activité transcriptionnelle de ce facteur. En effet, ils peuvent être remplacés par des résidus basiques sans que cela n’affecte la qualité de la transcription (Leuther et al. 1993).

4.2 La méthode (fig. 7)

Il existe ime littérature abondante sur cette méthode et ses améliorations (pour revues, Gietz R.D.et al 1997, Plessis et al, Bartel et al. 1995). Elle est utilisée dans des domaines aussi variés que l’étude du système nerveux (pour revue Nishimune et al. 1996), l’urologie (pour revue Gaston et al. 1999) ou encore l’endocrinologie (pour revue Pirson étal. 1999).

Ce système a originellement été mis au point par S. Fields et O. Song (1989). La méthode consistait à fusionner la séquence d’ADN complémentaire du gène d’intérêt au domaine de liaison à l’ADN de Gal4 et à introduire cette construction dans im plasmide sélectionnable dans une souche de levure appropriée. La fiision produite était capable de lier l’ADN au niveau du promoteur Gall artificiellement placé en amont d’un gène rapporteur. La souche était alors transformée avec une banque d’ADN complémentaires clonés dans un vecteur permettant de les exprimer en fusion avec le domaine activateur de Gal4. Le produit de cette double transformation était étalé sur un milieu sélectionnant les deux plasmides. Si les deux domaines de Gal4 étaient réunis par l’interaction entre des partenaires protéiques, une activité Gal4 fonctionnelle était reconstituée. Celle-ci était détectée par l’activation du gène rapporteur.

L’utilisation d’im tel système nécessite évidemment d’utiliser des souches de levures délétées en Gal4 et Gai 80. De plus, il implique que l’interaction ait lieu dans le noyau, que la région activatrice de GA14 soit accessible à la machinerie transcriptionnelle, et que

Introduction générale Le système double-hybride

l’hybride contenant le domaine de liaison de l’ADN de Gal4 n’active pas la transcription par lui-même.

Lorsque la protéine à étudier est un facteur de transcription contenant vm domaine d’activation, il est impossible de l’étudier telle quelle en double-hybride (à moins de déléter la région responsable de l’activation des gènes rapporteurs). Récemment, plusieurs domaines protéiques ont été identifiés comme possédant une activité répressive. La nature exacte de leur activité est inconnue, mais on pense que les domaines de répression interagissent avec les composants de la machinerie transcriptionnelle eucaryote de base ou régulatrice. L’utilisation d’une telle séquence en double-hybride permettrait d’étudier les interactions impliquant les facteurs de transcription.

La séquence SSB24, provenant de la région C-terminale riche en lysine de la protéine VacB de E. Coli, est capable de réprimer les domaines d’activation en cis, mais peut être surmontée par le domaine d’activation de Gal4 qui est apporté par le(s) partenaire(s) potentiel(s) de la protéine d’intérêt (Cormack et al. 1997).

Les banques d’ADNc sont construites sous forme d’hybrides avec le domaine activateur de Gal4, car de nombreuses séquences sont susceptibles d’activer la transcription, et leur fiision à un domaine de liaison à l’ADN conduirait à un bruit de fond très élevé (Ruden D.M. 1991).

4.3 Les faux-positifs rHengen P.N. 1997)

Malgré les précautions prises, le taux de faux-positifs générés par le système varie de 10 à 99 % des clones initialement isolés d’un criblage et ils peuvent être de plusieurs natures: l’hybride contenant le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 active seul la transcription, l’hybride isolé à l’issue du criblée et contenant un partenaire potentiel de la protéine d’intérêt est en réalité capable de lier le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 sans l’intervention de la protéine d’intérêt, ou même directement la machinerie transcriptionnelle fixée sur le promoteur,...