Análise dos resultados

Os cortes histológicos foram observados no microscópio Leica DMLB e as imagens foram digitalizadas em analisador de imagens no software Leica Q-win versão 3.1 para Windons TM

. Para análise dos dados foi utilizado teste estatístico para análise de variância ANOVA, com teste “a posteriori” de Tuckey-Kramer ou o teste não paramétrico de Kruskall-Wallis, com teste “a posteriori” de Dunn, de acordo com a característica de cada variável. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. As análises estatísticas foram realizadas no programa Instat (versão 3.0; GraphPad, Inc., San Diego, CA, USA).

RESULTADOS

Características gerais dos grupos experimentais. As médias das concentrações sanguíneas de glicose foram superiores a 250mg/dl, nos animais que receberam tratamento diabetogênico, sem reposição de insulina. A reposição simultânea e/ou tardia de insulina foi eficaz em reduzir os níveis de glicose no sangue a valores próximos aos dos animais dos grupos controle. As médias das concentrações sanguíneas de glicose dos grupos controle foram sempre inferiores ao limite máximo de normalidade (120mg/d) (dado não mostrado). O peso absoluto de todos os lobos prostáticos apresentou-se diminuído, ao final de cada período experimental, nos animais diabéticos tratados com STZ. Os animais diabéticos que receberam reposição exógena de insulina (tanto simultânea quanto tardia) apresentaram o peso dos lobos prostáticos semelhante aos controles (Figura 1).

Análise estereológica-morfométrica da área ocupada pelas fibras colágenas. A área ocupada pelas fibras colágenas foi significativamente maior nos animais diabéticos quando comparados aos controles (Figura 2). Os mesmos parâmetros quando analisados nos animais

diabéticos tratados com insulina mostraram padrões de medidas semelhantes aos controles (Tabela 2).

Determinação semiquantitativa da atividade das MMP-2 e MMP-9 através da técnica de zimografia. A análise dos géis por zimografia revelaram bandas claras típicas da atividade gelanolítica das MMPs-2 e -9, com diferencial expressão lobo-específica (Figura 3). Na próstata ventral (PV), em todos os grupos experimentais, em ambas as idades analisadas (60 e 80 dias) puderam ser visualizadas as bandas relativas às formas pró-enzima e enzima ativa da MMP- 9 (92 e 81 kDa, respectivamente) e as bandas relativas às formas pró, intermediária e enzima ativa da MMP-2 (respectivamente bandas de 72, 64, 57 kDa). Na próstata anterior (PA), puderam ser visualizadas as bandas relativa a forma ativa da MMP-9 e as forma pró, intermediária e ativa da MMP-2. Na PD puderam ser visualizadas as bandas relativa a forma pro e ativa da MMP-9 e as forma pró, intermediária e ativa da MMP-2. A análise densitométrica das bandas revelou que na PV dos animais diabéticos, aos 80 dias de idade, todas as bandas relativas a MMP-2 foram diminuídas (Figura 4). Nenhuma diferença estatística foi observada com relação a MMP-9 (Figura 5). Nos animais tratados com insulina, houve um aumento da enzima intermediária MMP-2 na PV aos 60 dias e ativa aos 80. Nos animais diabéticos mortos aos 60 dias de idade houve uma diminuição significativa das formas pró-, intermediária e ativa MMP2 na PA e da forma intermediária da MMP-2 aos 80 dias. Na PD, houve uma diminuição, embora não significativa das formas pró-, intermediária e ativa MMP-2.

DISCUSSÃO

No presente estudo, a redução do peso absoluto dos lobos da próstata dos animais tratados com STZ, durante o período de crescimento puberal, confirma dados da literatura de que o diabete interfere na homeostasia prostática prejudicando o crescimento da glândula (Soudamani et al., 2005; Ikeda 2000; Wang et al., 2000).

O diabete, tanto no homem como em animais experimentais, está associado a uma diminuição das concentrações plasmáticas de testosterona acompanhada por uma diminuição no peso das glândulas sexuais acessórias (Scarano et al., 2006; Ribeiro et al., 2006; Cagnon et al.,

2000; Wang et al., 2000). Os andrógenos são essenciais para crescimento, diferenciação e função prostática (Closset and Reiter, 2003). Ausência de andrógenos durante períodos específicos do desenvolvimento da próstata leva a uma diminuição da atividade proliferativa e aumento nos índices de apoptose, resultando na involução glandular (Justulin et al., 2010).

Por outro lado, tanto a reposição simultânea com insulina nos animais que foram induzidos com STZ aos 40 dias de idade, período de intensa proliferação na glândula, quanto a reposição tardia iniciada aos 60 dias de idade dos animais, foi efetiva em prevenir ou reverter os efeitos deletérios do diabete no peso da glândula. A insulina exerce um importante efeito no crescimento e diferenciação da próstata, estimulado proliferação celular in vitro (McKeehan et al., 1984). A presença de receptores de insulina nas células epiteliais prostáticas reforça a importância deste hormônio na glândula (Carmena et al., 1986).

Em nosso estudo, a matriz extracelular (MEC) que envolve as células estromais e as estruturas túbulo-alveolares da próstata mostrou significativo aumento na área ocupada pelas fibras do sistema colágeno (COL I e COL III) na próstata dos animais diabéticos. Da mesma forma, Ribeiro et al. (2006) encontraram modificações estruturais e quantitativas nos elementos fibrilares e estromais da próstata de ratos diabéticos adultos, com um acúmulo de colágeno abaixo da membrana basal, espessamento e ondulação das fibras reticulares e agregação de fibras colágenas. Estudos demonstram que a razão colágeno/epitelial normal na próstata é alterada quando da depleção androgênica em ratos (Vilamior et al., 2000) e as reduzidas concentrações plasmáticas de testosterona nos animais diabéticos podem ser a causa de tais alterações na organização e quantidade das fibras estromais. Por outro lado, é possível que os efeitos da hiperglicemia sejam mais acentuados no parênquima glandular e que o crescimento do compartimento estromal seja menos afetado.

Além disso, o diabete está associado com um significativo aumento das concentrações de glicose nos fluidos corporais. A glicose e outros açúcares redutores se ligam covalentemente a macromoléculas do organismo, tais como o colágeno, através de um processo de glicação não enzimática (Kilhovd et al., 2003). Estas glicosilações formam o que se denomina advanced

glycation endproducts (AGEs) ou produtos finais com avançado grau de glicosilação. AGEs-

alterados de colágeno é observado em animais e homens diabéticos (Aldrovani et al., 2008; Fosmark et al., 2006; Koga et al., 2002). Estudos sugerem que AGE de colágeno aumenta o

número de ligações cruzadas, tornando-se, portanto mais resistentes a degradação proteolítica por enzimas específicas (Howard et al., 2006). O acúmulo de colágeno pode ter um importante impacto no comportamento das células epiteliais basais e secretoras.

A reposição simultânea com insulina nos animais pré-puberes foi capaz de evitar os efeitos negativos da hiperglicemia no compartimento estromal observados nos ratos diabéticos. Porém, mais importante ainda foi verificar que as alterações produzidas na próstata de ratos por um período de 20 dias de hiperglicemia foram revertidas com 20 dias de tratamento tardio com insulina. Desta forma, pode se concluir que nesta fase da puberdade a próstata se apresenta muito dinâmica frente a alterações metabólicas e hormonais.

A MEC exerce um importante papel no comportamento celular estimulando a diferenciação, proliferação, migração e morfogênese. Regulação da proteólise por proteases dos elementos da MEC é essencial para diversos processos fisiológicos e patológicos. No presente estudo, a atividade das MMP-2 e MMP-9 foi analisada através da técnica de zimografia. O lobo lateral da próstata foi excluído do estudo por ser frequente e espontaneamente acometido por processos inflamatórios. Nossos resultados demonstraram que nos animais diabéticos houve uma diminuição da atividade gelanolítica das MMPs -2 e MMP-9 o que pode estar relacionado com um menor crescimento glandular e com o acúmulo de colágeno observado nos estroma dos diferentes lobos da próstata. Bruni-Cardoso et al. (2008) demonstraram que as MMPs -2 e -9 são importantes durante o desenvolvimento prostático, influenciando processo de proliferação celular, ramificação dos ductos e invasão epitelial no estroma. Estes autores sugerem que estas enzimas também estejam envolvidas no processo de crescimento da próstata durante a puberdade.

Além disso, podemos sugerir que a redução na atividade da MMP-2 e MMP-9 pode estar relacionadas com os baixos níveis de testosterona observados nos animais diabéticos. Embora a regulação da expressão das MMPs na próstata não esteja completamente esclarecida, alguns estudos demonstraram que a expressão destas enzimas pode ser regulada pela sinalização do receptor de andrógeno (Limaye et al., 2008; Liao et al., 2003, Justulin et al., 2010).

Aparentemente, os efeitos adversos do diabete na próstata de ratos adultos se assemelham aos da castração (Justulin et al., 2006; Vilamoior et al., 2000). A castração promove uma reorganização fibrilar dos componentes da matriz extracelular tais como acúmulo de fibras do sistema colágeno e do sistema elástico (Carvalho et al., 1997).

A expressão das MMPs na próstata está relacionada a processos normais e patológicos que envolvem remodelação tecidual (Wilson et al., 1995). A síndrome diabética afeta diferentemente os órgãos e tecidos do corpo. Da mesma forma, a regulação das MMPs no diabete parece diferir sob diferentes condições experimentais. Trabalhos com cultura de células endoteliais expostas à hiperglicemia demonstraram uma redução na secreção de MMP-2 e MMP- 9 (Gharagozlian et al., 2006). Por outro lado, os níveis séricos de MMP-2 e MMP-9 foram significativamente maiores em indivíduos com diabetes tipo I, sugerindo que estas enzimas podem ser potencialmente úteis como marcadores do risco de doenças renais em pacientes crônicos.

Nosso estudo é o primeiro a avaliar os efeitos do diabetes e da reposição com insulina sobre a atividade das MMPs na próstata de ratos. A literatura carece de estudos sobre o quanto a hiperglicemia decorrente do diabete e a ausência ou resistência à insulina regulam ou interferem na atividade das MMPs. Assim, estudos são necessários para esclarecer esta relação. No contexto da biologia prostática, nosso estudo demonstra que o diabete tipo 1, durante o período de intenso crescimento prostático, causou importantes alterações na organização e deposição das fibras colágenas no estroma da próstata dos animais diabéticos e reduziu a atividade das MMP-2 e -9. O tratamento com insulina foi efetivo em manter a atividade destas enzimas na próstata.

Agradecimentos

Este trabalho teve o apoio financeiro da Fundação a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPES, processo número:06/60115-2-p/SLF e 06/60116-9 p/EMP).

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