Na figura 1, verifica-se que a porcentagem de germinação não foi afetada quando o retardamento da secagem foi realizado em temperaturas mais amenas (20 e 40 ºC) com umidades de colheita abaixo de 40,5% (Figuras 1B, 1C, 1D e 1E), ou seja, as sementes podem permanecer nessas temperaturas por até 48 horas sem prejuízos na viabilidade.
Contudo, quando as sementes foram colhidas com alta umidade (48%) ocorreram alterações na capacidade germinativa de acordo com o tempo de retardamento da secagem (Figura 1A). Até aproximadamente 12 horas, o retardamento da secagem sob temperaturas de 20 e 40 ºC se mostrou benéfico, aumentando a capacidade germinativa das sementes, fato também encontrado em outros trabalhos (ROSA et al., 2004, 2005). Após esse período, houve uma tendência de queda na germinação.
Verificou-se, entretanto, perda significativa da viabilidade quando as sementes foram acondicionadas a 60 ºC em todas as umidades de colheita (FIGURAS 1A, 1B, 1C, 1D E 1E). Nessa temperatura, a deterioração e a respiração são aceleradas, com consequente consumo de reservas, além de desnaturação de proteínas e alterações isoenzimáticas provocando reduções na qualidade fisiológica (RANGEL; SILVA; NERIS, 2003).
A linha vermelha (Figura 1) representa 70% de germinação, que é o padrão mínimo para linhagens exigido pelo Governo Federal (BRASIL, 2005). Salienta-se que, no controle interno das empresas produtoras de sementes, a exigência é maior, sendo considerado baixo 70% de germinação.
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Figura 1 Porcentagem de germinação de sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48% (A), 40,5% (B), 34,2 (C), 29,4% (D) e 23,5% (E) de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem sob três temperaturas. A linha vermelha representa 70% de germinação.
No ponto de colheita mais úmido, a germinação das sementes ficou abaixo do padrão antes de 1 hora de espera pela secagem sob 60 °C (Figura 1A). Nos pontos de colheita de 40,5 e 34,2% de umidade, as sementes podem ficar sob 60 °C por até, aproximadamente, 6 horas, sem atingir valores de germinação abaixo da exigência legal (Figuras 1B e 1C). A tolerância a altas temperaturas foi encontrada somente quando a colheita foi realizada com menores graus de umidade, sendo que as sementes colhidas com 29,4 e 23,5% de umidade podem permanecer até 18 horas nessa temperatura sem atingir valores abaixo do exigido para a comercialização (Figuras 1D e 1E).
Estudos realizados com diferentes metodologias de secagem corroboram com os resultados aqui apresentados concluindo que altas temperaturas são prejudiciais às sementes de milho, principalmente quando estas se encontram com alto teor de água (EICHOL; PERES, 2008; JORGE et al., 2005; JOSÉ et al., 2005; ROSA et al., 2004, 2005). A mesma relação entre umidade das sementes e o efeito danoso de altas temperaturas pode ser verificada, também, durante o retardamento da secagem.
No teste de emergência (Figura 2), o efeito do retardamento da secagem foi semelhante ao verificado para a porcentagem de germinação. Não houve variação quando o período de espera foi sob temperaturas de 20 e 40 °C, mantendo-se acima de 95% de emergência, com exceção da colheita mais úmida (48%) (Figura 2A). Nesse ponto, observa-se um aumento do vigor das sementes quando o retardamento da secagem se deu sob 40 ºC por até, aproximadamente, 12 horas e, após isso, uma tendência de queda.
A 60 ºC ocorreu redução na porcentagem de emergência ao longo dos períodos de espera antes da secagem, atingindo níveis muito baixos, chegando à nulidade antes de 30 horas nos pontos mais úmidos de colheita (Figuras 2A, 2B e 2C). Nos pontos de colheita mais tardios (29,4 e 23,5% de umidade), houve
maior tolerância à alta temperatura, observando-se, entretanto, perdas significativas (Figuras 2D e 2E).
A B
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Figura 2 Porcentagem de emergência de sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48% (A), 40,5% (B), 34,2 (C), 29,4% (D) e 23,5% (E) de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem sob três temperaturas.
A mesma tendência foi observada para os índices de velocidade de emergência (Figura 3) nos quais se verificou uma perda significativa do vigor das sementes somente quando o retardamento da secagem ocorreu sob temperatura de 60 °C, com rápido declínio do índice de velocidade de emergência.
Em temperaturas mais baixas (20 e 40 °C), o índice de velocidade de emergência não foi comprometido com o retardamento da secagem, atingindo valores entre 8 e 10, aproximadamente.
Vale ressaltar a relação existente entre emergência em canteiro e o índice de velocidade de emergência (IVE). O resultado da emergência se refletiu no IVE, mostrando sementes vigorosas com emergência rápida, mesmo sob condições adversas, o que também pode ser encontrado em vários outros trabalhos (COAN et al., 2008; CONCEIÇÃO et al., 2012; FREITAS et al., 2002; TORRES, 1998).
Já no teste de frio, a perda do vigor foi mais bem evidenciada (Figura 4). Em geral, nos três pontos de colheita mais úmidos, 48, 40,5 e 34,2% de teor de água (Figuras 4A, 4B e 4C), observou-se tendência de redução no vigor das sementes nas três temperaturas estudadas. Somente nos dois últimos pontos de colheita, com 29,4 e 23,5% de umidade (Figuras 4D e 4E), a emergência após o teste de frio se manteve constante e alta em sementes que permaneceram sob temperaturas amenas (20 e 40 ºC) durante o retardamento da secagem.
Com estes resultados, evidencia-se a necessidade de rápido início da secagem artificial para evitar perdas, principalmente quando a colheita for com sementes com teor de água superior a 34,2% de umidade. Verificou-se que a emergência após o estresse por frio é tanto menor quanto maior for a umidade de colheita das sementes e maiores os períodos de retardamento da secagem.
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Figura 3 Índice de velocidade de emergência de sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48% (A), 40,5% (B), 34,2 (C), 29,4% (D) e 23,5% (E) de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem sob três temperaturas.
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Figura 4 Teste de frio de sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48% (A), 40,5% (B), 34,2 (C), 29,4% (D) e 23,5% (E) de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem sob três temperaturas.
Muñoz e Arboleda (1976) verificaram que a viabilidade de sementes de milho colhidas com teores de água de 43 e 37% não sofre prejuízos quando houve o retardamento do processo de secagem por períodos de 0 até 3 dias. Resultado este que corrobora com esta pesquisa se a espera pela secagem tiver sido feita sob temperaturas amenas, fato não especificado no trabalho.
Já Borba et al. (1998), trabalhando com colheita de sementes a granel com 16 e 21% de umidade, estudaram os efeitos do retardamento da secagem por períodos entre 0 e 156 horas e concluíram que, para a germinação, a secagem pode ser retardada por um período de 156 e 85 horas, para teores de água das sementes de 16 e 21%, respectivamente. Com relação ao vigor, a redução foi linear, evidenciando que quanto maior a espera pela secagem, maiores são as perdas ocasionadas. Corroborando com os resultados de que quanto maior a umidade de colheita, menor a tolerância a estresses causados pelo retardamento da secagem.
Scaranari (1997), estudando sementes de milho da cultivar BR 3123 colhidas com 35% de umidade e tendo sua secagem retardada de 0 a 120 horas, à temperatura ambiente, concluiu que não houve alteração na qualidade fisiológica das sementes por até 6 meses de armazenamento. Fato devido, provavelmente, à temperatura ambiente não ter sido alta.
Em trabalhos similares com outras espécies, Eichelberger et al. (2003) e Torres (2006) trabalhando com sementes de azevém anual e sorgo granífero, respectivamente, constataram que o retardamento da secagem afetava adversamente a qualidade das sementes e que este efeito era tanto maior quanto mais altos forem a umidade inicial e o tempo de espera, corroborando claramente com os resultados obtidos nesta pesquisa.
4.2 Análise isoenzimática
Verificou-se que sementes mais vigorosas foram obtidas quando as sementes foram colhidas com menores teores de água. Esse fato provavelmente se deve ao estádio mais avançado de maturação das sementes e à sua maior tolerância a altas temperaturas, fato intrinsecamente relacionado com o acúmulo de proteínas resistentes ao calor, que acontece no final da maturação das sementes (CHE et al., 2006; ROSA et al., 2005).
Esse acúmulo foi evidenciado pela análise eletroforética das proteínas resistentes ao calor (Figura 5). A análise foi feita em três pontos de umidade de colheita, 48, 34,2 e 23,5%, sendo os pontos extremos (mais úmido e mais seco) e o intermediário, o qual corresponde ao ponto de maturidade fisiológica de sementes de milho, de acordo com Fessel et al. (2001).
Figura 5 Padrão eletroforético de proteínas resistentes ao calor em sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48, 34,2 e 23,5% de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem por 6, 24 e 48 horas sob as temperaturas de 20 e 60 °C. Testemunha representa sementes não submetidas ao retardamento da secagem.
Verificou-se que a intensidade das bandas aumentou ao longo da maturação das sementes. Quando as sementes foram colhidas com 48% de
umidade, não há expressão dessas proteínas, com exceção dos tratamentos testemunha (0 hora) e 6 horas sob 20 ºC. Este último ajuda a explicar o ganho de viabilidade com o retardamento da secagem por até 12 horas, sob temperaturas amenas, quando as sementes foram colhidas com alta umidade (48%), como visto no teste de germinação (FIGURA 1).
No ponto de maturidade fisiológica (34,2% de umidade), há uma expressão intermediária dessas proteínas, o que confere uma maior tolerância a altas temperaturas. E no ponto de colheita mais tardio (23,5% de umidade) há o máximo de expressão dessas proteínas, explicando claramente o porquê dessas sementes serem mais tolerantes ao estresse por altas temperaturas, como pode ser verificado pelos testes de viabilidade e vigor supracomentados.
Pelos resultados, pode-se afirmar que este sistema proteico pode ser considerado como atuante mecanismo de proteção celular, principalmente sob altas temperaturas. Isso explica a maior qualidade fisiológica nos pontos de colheita com menor teor de água nas sementes, com o retardamento da secagem sob 60 °C.
Rosa et al. (2005) verificaram que mediante pré-condicionamento à baixa temperatura (35 °C), há condições propícias para a síntese dessas proteínas, induzindo tolerância à secagem sob temperaturas mais elevadas. Thomann et al. (1992), estudando o efeito de secagem lenta durante o desenvolvimento de sementes de milho, verificaram acúmulo de proteínas resistentes ao calor em fase correspondente à aquisição de tolerância à dessecação.
Além disso, a análise eletroforética de outros complexos enzimáticos pode corroborar para um maior esclarecimento dessa questão. O complexo enzimático antioxidante das sementes, responsável por impedir a ação deletéria de agentes oxidantes, a exemplo do peróxido de hidrogênio (H2O2), do
2010; FARRANT; BRANDT; LINDSEY, 2007), é representado neste trabalho pelas seguintes enzimas: catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e peroxidase (PO). Vale ressaltar que o sistema de defesa antioxidante é mais expressivo em sementes ortodoxas, como o milho (KRANNER; BIRTIC, 2005; SPANÒ et al., 2011).
Durante a dessecação das sementes, observa-se um acúmulo desses compostos e de radicais livres nas células (NTULI et al., 2011). A enzima superóxido dismutase (SOD) é responsável por realizar a dismutação do radical superóxido (O2-) a peróxido de hidrogênio (H2O2), já as enzimas catalase e
peroxidase, por sua vez, promovem a conversão do H2O2 a água e oxigênio
molecular, ambos não danosos às células (MITTLER, 2002).
As enzimas SOD (Figura 6A) e CAT (Figura 6B) apresentaram resultados bem semelhantes. No ponto de colheita mais úmido, com 48% de umidade, houve expressão, mas em menor intensidade. Nos tratamentos de 24 e 48 h sob 60 ºC praticamente não houve expressão dessas enzimas, provavelmente pela desnaturação causada pela alta temperatura. Isso ajuda a explicar a perda da viabilidade e vigor acentuada nas sementes desses tratamentos.
Figura 6 Padrão eletroforético das enzimas superóxido dismutase (SOD) (A), catalase (CAT) (B) e peroxidase (PO) (C) em sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48%, 34,2 e 23,5% de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem por 6, 24 e 48 horas sob as temperaturas de 20 e 60 °C. Testemunha representa sementes não submetidas ao retardamento da secagem.
A expressão dessas enzimas no ponto intermediário de umidade de colheita (34,2%) foi mais acentuada, devido ao estádio mais avançado de maturação dessas sementes, sendo que o aparato antioxidante está funcionando mais eficientemente se comparado ao ponto mais úmido de colheita. E os tratamentos de 24 e 48 h sob 60 ºC também, praticamente, não apresentou bandas.
Já as sementes colhidas no ponto mais tardio (23,5%) apresentaram a maior intensidade de bandas das enzimas SOD e CAT, e isso em todos os tratamentos, inclusive os de maior estresse, de 24 e 48h sob 60 ºC. Isso corrobora com o fato de que quanto mais tardia for a colheita, maior a tolerância a estresse por altas temperaturas verificada pelos testes de qualidade fisiológica, tanto de viabilidade quanto de vigor.
Bonome (2006) e Silva (2007) observaram um incremento da atividade da catalase em fases mais avançadas de deterioração em sementes de citrumelo ‘swingle’ e seringueira, respectivamente. Já Bailly et al. (1996) e Jeng e Sung (1994) verificaram redução na atividade da catalase com o envelhecimento de sementes de amendoim e girassol. Rosa et al. (2005) verificaram que a tolerância de sementes de milho à temperatura de secagem (50 ºC) também está associada à atividade da enzima catalase e pouco relacionada às atividades das enzimas peroxidase e superóxido dismutase, essas duas últimas mais relacionadas com o processo de deterioração.
Para a peroxidase (Figura 6C), a expressão foi mais contrastante. Os primeiros pontos de colheita (48 e 34,2% de umidade) praticamente não apresentaram atividades, significando a ausência dessa enzima no complexo antioxidante. Já no ponto de colheita mais seco (23,5% de umidade), a expressão foi visível e significativa, explicando a tolerância mais acentuada dessas sementes quando submetidas ao estresse.
Padrões eletroforéticos de enzimas relacionadas com o processo respiratório também são de grande valia como marcadores de qualidade fisiológica. Dentre as mais importantes estão a álcool desidrogenase (ADH) e a malato desidrogenase (MDH).
A ADH atua no metabolismo anaeróbico, em que o acetaldeído é reduzido a etanol (BUCHANAN; GRUISSEM; JONES, 2005). Os produtos finais desse metabolismo fermentativo são tóxicos para as células, mas o etanol parece ser o produto do metabolismo fermentativo menos deletério comparado ao acetaldeído (ZHANG et al., 1994). Dessa forma, a álcool desidrogenase pode ser considerado um marcador de qualidade fisiológica, por sua baixa atividade representar um risco para a semente.
Verifica-se pela intensidade das bandas (Figura 7A), que no ponto de colheita mais úmido (48,0%), bem como no ponto intermediário (34,2%) houve presença das bandas em quase todos os tratamentos. Somente quando as sementes passaram por um período de retardamento de secagem maior que 24 horas a 60 ºC, a expressão não foi encontrada, o que significa a ausência dessa enzima ou inativação por alta temperatura.
Esse resultado corrobora com Brandão Junior (1996), que observou uma diminuição da intensidade das bandas dessa enzima com o aumento do tempo de envelhecimento.
Já em sementes colhidas no ponto de colheita mais tardio (23,5%) observou-se a expressão em todos os tratamentos, indicando assim maior tolerância dessas sementes ao retardamento da secagem em altas temperaturas.
Em milho, essa enzima apresenta dois locos fortemente ligados (Adh1 e Adh2), os quais são muito estudados sob o aspecto de regulação da expressão gênica por terem função definida sob condições anaeróbicas (TORGGLER; CONTEL; TORGGLER, 1995).
Figura 7 Padrão eletroforético das enzimas álcool desidrogenase (ADH) (A) e malato desidrogenase (MDH) (B) em sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48%, 34,2 e 23,5% de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem por 6, 24 e 48 horas sob as temperaturas de 20 e 60 °C. Testemunha representa sementes não submetidas ao retardamento da secagem.
A enzima malato desidrogenase é uma enzima do ciclo de Krebs que transforma o malato em oxaloacetato produzindo um NADH, o qual é utilizado para gerar energia. Desta forma esta enzima está ligada a geração de energia para processos metabólicos importantes como a germinação das sementes. Além disso, participa do movimento do malato por meio da membrana mitocondrial e da fixação de CO2 das plantas (TAIZ; ZEIGER, 2009).
A análise da banda comum no padrão isoenzimático da MDH (Figura 7B) revelou o mesmo padrão da ADH, ou seja, não foram encontradas expressões dessa enzima quando as sementes colhidas com 48,0 e 34,2% de umidade foram submetidas ao retardamento da secagem por 24 ou 48 horas a 60 ºC. Já no ponto de colheita mais tardio (23,5% de umidade), a expressão pode ser vista em todos os tratamentos, o que pode ser relacionado à qualidade fisiológica das sementes.
Brandão Junior (1996) não observou correlações entre a atividade da malato desidrogenase e a qualidade fisiológica de lotes de milho, e também Satters, Abdel-Guany e Elbagoury (1994) verificaram que essa enzima foi a menos afetada pelos tratamentos de envelhecimento em sementes de soja.
A esterase (EST) participa da hidrólise de ésteres de membrana e está diretamente ligada ao metabolismo de lipídios (SANTOS; MENEZES; VILLELA, 2004). Muitos desses lipídios são constituintes de membranas, e sua degradação aumenta quando se aumenta a deterioração.
Pelo padrão enzimático da esterase (Figura 8) verifica-se que sementes colhidas com alta umidade (48,0 e 34,2%) submetidas ao retardamento da secagem por mais de 24 horas á 60 ºC têm suas enzimas inativadas ou desnaturadas. E, sementes colhidas no ponto mais seco (23,5%) conseguem tolerar melhor esse estresse e ainda mantêm ativas suas enzimas, o que, consequentemente, confere maior viabilidade e vigor.
Figura 8 Padrão eletroforético da enzima esterase (EST) em sementes de milho da linhagem GNS25 colhidas com 48%, 34,2 e 23,5% de teor de água e submetidas ao retardamento de secagem por 6, 24 e 48 horas sob as temperaturas de 20 e 60 °C. Testemunha representa sementes não submetidas ao retardamento da secagem.
O resultado dessas três enzimas (ADH, MDH e EST) corrobora perfeitamente com os resultados dos testes de viabilidade e vigor realizado, onde as sementes colhidas com umidades altas toleram menos o retardamento da secagem, principalmente sob altas temperaturas. Já sementes colhidas com menores teores de água possuem maior tolerância ao estresse causado pelo retardamento da secagem, propiciando plântulas mais vigorosas.
4.3 Análise ultraestrutural
A análise ultraestrutural por meio da microscopia eletrônica de varredura pode ser uma interessante aliada para melhor compreensão dos danos causados pelo retardamento da secagem em sementes de milho.
Sabe-se que a manutenção da integridade das membranas celulares, entre outros eventos, é um forte indicativo de alterações da qualidade das sementes (SAATH et al., 2010).
As sementes colhidas com alto teor de água, 48,0% de umidade, apresentam células ainda não totalmente formadas, com espaços porosos,
mesmo não submetidas ao retardamento da secagem (Figura 9A). Talvez pelo fato de ainda não ter atingido o Ponto de Maturidade Fisiológico, onde detém o maior acúmulo de massa seca. Mesmo assim, a membrana está íntegra, e a turgidez é um indicativo da ausência de dano estrutural.
Quando submetidas ao retardamento da secagem por 48 horas sob 60 ºC de temperatura houve rompimento da membrana celular com consequente extravasamento do citoplasma (Figura 9B), o que causou perda da viabilidade e funcionalidade celular com consequente morte da semente, o que pode ser verificado pelo teste de germinação.
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Figura 9 Imagens de embriões de sementes de milho da linhagem GNS25 obtidas por meio de eletromicrografia de varredura. A imagem A representa a testemunha (sem retardamento da secagem) e a imagem B foi obtida em sementes com retardamento da secagem por 48 horas a 60 ºC, ambas colhidas com 48,0% de umidade.
Para o ponto de colheita correspondente ao ponto de maturidade fisiológica das sementes, com 34,2% de umidade (Figura 10A), as células das sementes que não foram submetidas ao retardamento da secagem estavam túrgidas e expandidas, o volume celular apresentava-se com conteúdo celular intacto e células e sem contração. Essa alta qualidade explica o alto vigor encontrado nos testes fisiológicos.
Já as sementes submetidas ao retardamento da secagem por 48 horas sob 60 ºC (Figura 10B) apresentaram rupturas da membrana plasmática, com perda de material citoplasmático e perda das funções vitais, causando a morte da semente. Evento este comprovado pelo baixo desempenho nos testes de viabilidade e vigor.
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Figura 10 Imagens de embriões de sementes de milho da linhagem GNS25 obtidas por meio de eletromicrografia de varredura. A imagem A representa a testemunha (sem retardamento da secagem) e a imagem B foi obtida em sementes com retardamento da secagem por 48 horas a 60 ºC, ambas colhidas com 34,2% de umidade.
O padrão observado nos primeiros pontos de colheita só foi alterado no ponto de colheita mais tardio, com 23,5% de umidade. Conforme visto nos testes fisiológicos, essas sementes apresentaram maior tolerância ao estresse por alta temperatura, e mesmo quando retardada a secagem por 48 horas sob 60 ºC, ainda sim mantiveram certo grau de viabilidade e vigor.
Na figura 11A, observa-se que quando as sementes não foram submetidas ao retardamento da secagem, suas células se mantiveram túrgidas, intactas e com o material celular preenchendo todo o espaço. Mas quando submetidas ao retardamento mais drástico (48 horas a 60 ºC), houve uma retração celular com a perda brusca de água pelas células (Figura 11B). Mas, vale ressaltar, que não houve rompimento nem extravasamento celular, o que demonstra que o dano causado pelas altas temperaturas é mais interno do que no nível de membrana.
Em trabalho semelhante com café, foram obtidos resultados similares, com desestruturação de membranas e extravasamento celular quando a temperatura de secagem foi de 60 ºC. E à temperaturas menores, houve a manutenção do conteúdo celular com retração das células (SAATH et al., 2010).
Carvalho et al. (1999) observaram que danos internos ocasionados pelas condições adversas de temperatura e umidade de pré-colheita não causam perda de germinação e vigor de sementes de milho. Contudo, quando o dano se dá no eixo embrionário, na posição perpendicular, há prejuízo fisiológico.
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Figura 11 Imagens de embriões de sementes de milho da linhagem GNS25 obtidas por meio de eletromicrografia de varredura. A imagem A representa a testemunha (sem retardamento da secagem) e a imagem B foi obtida em sementes com retardamento da secagem por 48 horas a 60 ºC, ambas colhidas com 23,5% de umidade.
4.4 Atividade respiratória
A mensuração da atividade respiratória de sementes pode ser de grande valia como um teste de vigor complementar. Sabe-se que mitocôndrias em sementes secas e no início do processo de embebição, não têm um sistema