Todos os dados foram apresentados como média e desvio padrão. Dados bioquímicos foram analisados através de ANOVA por análise de variância de uma via e post hoc Tukey. As análises estatísticas foram feitas por SPSS versão 20.0, com diferenças significativas quando o valor de P < 0,05.
5 RESULTADOS
Nossos resultados iniciais mostram através do gráfico 1 o dano oxidativo em lipídios no cerebelo, estriado, hipocampo, pré-frontal e córtex após 12 horas da indução de CLP. O DD se mostrou eficaz na diminuição dos danos em todas as estruturas cerebrais avaliadas. Enquanto o EB foi eficaz no cerebelo, estriado e pré- frontal e apresentou níveis de peroxidação lipídica maiores que o DD no cerebelo, hipocampo e pré-frontal.
Gráfico 1 - Níveis de TBARS em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 12 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Em relação ao dano oxidativo em proteínas após 12 horas da indução do CLP foram observados níveis aumentados no cerebelo, estriado e pré-frontal. E tanto DD quanto EB se mostraram eficazes na redução dos danos em tais regiões cerebrais (Gráfico 2).
Gráfico 2 - Níveis de proteínas carboniladas em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 12 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Ainda em 12 horas, avaliamos a atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (Gráfico 3), onde o modelo CLP mostrou diminuição da atividade do complexo I no hipocampo e no córtex enquanto a administração de DD aumentou a atividade de tal complexo no hipocampo, não havendo resposta para o tratamento com EB.
Gráfico 3 - Níveis da atividade do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 12 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Já para a atividade do complexo II houve uma diminuição nos níveis da atividade do complexo no cerebelo, estriado e hipocampo, sendo que a administração de DD mostrou aumento na atividade nas três estruturas e o EB apenas no hipocampo conforme demostrado no gráfico 4.
Gráfico 4 - Níveis da atividade do complexo II da cadeia respiratória mitocondrial em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 12 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Em relação à atividade do complexo IV observamos uma diminuição no grupo CLP no cerebelo, estriado, hipocampo e pré-frontal. A administração de DD aumentou a atividade em todas as regiões enquanto o EB apenas no hipocampo (Gráfico 5).
Gráfico 5 - Níveis da atividade do complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 12 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Finalmente para o tempo de 12 horas após indução da sepse observamos de acordo com o gráfico 6 a diminuição da atividade da enzima CK em todas as estruturas estudadas. Sendo que DD e EB alteraram significativamente tais níveis somente no cerebelo.
Gráfico 6 - Níveis da atividade da CK em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 12 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Quando avaliados os parâmetros anteriormente citados no tempo de 24 horas após CLP verificamos inicialmente que conforme o gráfico 7 houve um aumento no dano em lipídios em diferentes estruturas. Em todos os casos apenas o DD se mostrou eficaz na diminuição dos danos, enquanto o EB aumentou o dano que foi atenuado através da administração de DD.
Gráfico 7 - Níveis de TBARS em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 24 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Em relação ao dano a proteínas (Gráfico 8) observamos um aumento no cerebelo, hipocampo, pré-frontal e córtex no grupo CLP em relação ao sham. E em todos os casos tanto a administração de DD como de EB reduziram a formação de proteínas carboniladas.
Gráfico 8 - Níveis de proteínas carboniladas em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 24 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Na avaliação dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial para o tempo de 24 horas após a cirurgia, verificamos em relação a atividade do complexo I que apenas no hipocampo teve sua atividade diminuída devido a indução de sepse e os compostos de selênio não reverteram tal dano (Gráfico 9).
Gráfico 9 - Niveis da atividade do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em estruturas cerebrais de ratos submetidos a sepse e tratados com DD ou EB 24 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Para a atividade do complexo II observou-se que a indução da sepse diminui tal parâmetro no cerebelo, estriado, hipocampo e córtex em contrapartida o DD aumentou a atividade em todas as regiões cerebrais e o EB apenas no córtex (Gráfico 10).
Gráfico 10 - Níveis da atividade do complexo II da cadeia respiratória mitocondrial em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 24 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Conforme verificamos no gráfico 11, os ratos submetidos ao modelo CLP tiveram para o complexo IV sua atividade diminuída em todas as estruturas cerebrais estudadas. E todas mostraram um aumento da atividade devido a administração de DD o que não ocorreu com a administração de EB.
Gráfico 11 - Níveis da atividade do complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 24 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
Fonte: Elaboração da autora, 2013.
Finalmente, de acordo com o gráfico 12, houve diminuição da atividade da CK 24 horas após a cirurgia no grupo CLP no cerebelo, estriado, hipocampo e córtex. No entanto, apenas no hipocampo a administração de DD aumentou tal atividade enquanto o EB não mostrou resposta.
Gráfico 12 - Níveis da atividade da CK em estruturas cerebrais de ratos submetidos à sepse e tratados com DD ou EB 24 horas após a sepse.
Dados são expressos como media ± desvio padrão. * p<0.05 em relação ao grupo sham+veiculo, # p<0.05 em relação ao grupo CLP+ veiculo e $ p< 0.05 em relação ao grupo CLP + DD.
6 DISCUSSÃO
Sepse severa está associada com disfunção de múltiplos órgãos incluindo disfunção cerebral chamada encefalopatia séptica. Sua fisiopatologia ainda não é totalmente entendida, mas vários mecanismos têm sido propostos e parece envolver danos celulares direto ao cérebro, disfunção mitocondrial e endotelial, distúrbios em neurotransmissores e alteração na BHE (SIAMI; ANNANE; SHARSHA, 2008).
Demonstramos neste estudo que os danos oxidativos são eventos encontrados precocemente na sepse. Durante as primeiras horas há a produção de citocinas e quimiocinas, que parecem participar tanto na disfunção cerebral quanto de alterações de permeabilidade da BHE, o que reforça o papel da resposta inflamatória na disfunção aguda do SNC associada à sepse (COMIM et al., 2011). Recente estudo mostra o envolvimento das metaloproteinases (MMP) na quebra da BHE, pois ativadas por citocinas inflamatórias estas enzimas agem na clivagem da matriz extracelular (DAL-PIZZOL et al., 2013). E o estresse oxidativo está envolvido em toda essa gênese, devido a exacerbação da migração de leucócitos para o SNC em decorrência da resposta inflamatória e quebra da BHE e nesse sentido são responsáveis pelo aumento da produção de EROs levando ao dano celular no SNC (COMIM et al., 2011).
O dano oxidativo em lipídios e proteínas foi observado nas estruturas cerebrais estudadas. De fato, o que se observou neste estudo foram efeitos benéficos dos compostos de selênio nos danos oxidativos causados pela sepse, sendo que o DD se mostrou mais eficaz na redução de tais danos comparado ao EB. Efeito benéfico do DD sobre os níveis de dano oxidativo em lipídios havia sido demonstrado em estudo sobre danos no fígado de ratos com sepse (PRAUCHNER; PRESTES; ROCHA, 2011). DD também mostrou uma maior capacidade em diminuir a peroxidação lipídica no cérebro de ratos em comparação com os outros três compostos de selênio em modelo in vitro (SANTOS, 2009). Além disso, recentemente verificou-se que o DD mostrou maior aumento da atividade da GPx em relação ao ebselen em resposta a danos endoteliais mediada por peroxinitrito (BEM et al., 2013). A propriedade anti-inflamatória do DD também foi demonstrada em modelo de pleurisia induzida por carragenina em ratos, através da inibição do influxo de leucócitos e de citocinas pró-inflamatórias (LUCHESE et al., 2012). O DD
reduz marcadamente citocinas pró-inflamatórias em plasma e restaurou marcadores de danos cerebrais em ratos com isquemia cerebral (BRÜNING et al., 2012).
Acredita-se na eficácia dos compostos de selênio pela ação mimética a enzima GPx. Sob determinadas condições inflamatórias, a glutationa regula as interações leucócitos-células endoteliais na microvasculatura cerebral (WONG et al., 2011). A função antioxidante da glutationa desempenha um papel crítico na proteção da microvasculatura cerebral contra a isquemia, preservando a perfusão microvascular e a inibindo a expressão de MMP (WONG et al., 2008). Neste sentido, a glutationa mitocondrial é vital na proteção das células contra o estresse oxidativo, pois a maioria das EROS celulares são geradas na mitocôndria, por isso a depleção de glutationa mitocondrial pode levar a disfunção mitocondrial e apoptose (DUKHANDE et al., 2013).
Estudos indicam que o metabolismo energético é fundamentalmente alterado em nível celular durante sepse (COMIM et al., 2011; PERUCHI et al., 2011). Messaris, Memos e Chatzigianni, (2004) demonstraram apoptose neuronal aguda (6- 12 horas) mediada pela mitocôndria em cérebros de ratos submetidos a sepse. Estudos anteriores demonstraram que o funcionamento adequado da fosforilação oxidativa mitocondrial é comprometida durante a sepse devido a danos na membrana mitocondrial. Os elétrons que normalmente tem um fluxo através da cadeia transportadora são desviados, gerando ânion superóxido. (CROUSER, 2004). Este processo pode ser bem tolerado pela célula com a atividade de enzimas antioxidantes, porém foi demonstrado que tal atividade é comprometida durante o processo de sepse (ANDRADES et al., 2005). Tal fato pode explicar a diminuição da atividade dos diferentes complexos que encontramos em nosso estudo, visto que com a ação principalmente de DD agindo como um mimético da GPx poderia reverter o dano a membrana mitocondrial e consequentemente aos complexos estudados.
Quando a atividade de algum complexo mitocondrial é diminuída a produção de ATP proveniente da fosforilação oxidativa mitocondrial é comprometida. Neste contexto, a creatina quinase desempenha um papel importante no metabolismo energético produzindo ATP para complementar a baixa produção e garantir aos tecidos energia suficiente para que não ocorra dano celular ou protegendo o cérebro contra oscilações energéticas (LIPSKAYA, 2001). Em estudos anteriores a atividade cerebral da creatina quinase mostrou-se alta nas primeiras
horas (6 horas) após a sepse, sendo que há uma diminuição com o passar do tempo (12 horas). Neste contexto, a reação da creatina quinase pode compensar parcialmente a perda energética mitocondrial, ou seja, se não for rapidamente corrigido pelo fosforilação oxidativa, a consequência é a irreversível morte celular (SINGER, 2007). Encontramos em nosso estudo uma diminuição da atividade da CK em diferentes estruturas estudadas e sabe se que a CK apresenta muitos resíduos de cisteína em sua estrutura (ANDRES et al., 2008). Nesse sentido, grupos sulfidrilas da enzima CK podem ser um importante alvo para oxidação através do NO e outras EROs, principalmente na inibição da CK (WOLOSKER; PANIZZUTTI; 1996). Nesse contexto, podemos perceber que o estresse oxidativo pode estar envolvido no mecanismo de inibição da CK (BARICHELLO et al., 2008). Verificamos, portanto, uma reversão apenas no hipocampo para a atividade da CK em 24h com a administração de DD. Sabe-se que o dano oxidativo parece ser dependente ainda da região do SNC estudada, sendo demonstrado mais consistentemente no hipocampo (BARICHELLO et al., 2006).
Quando falamos de compostos orgânicos de selênio nos remete a ideia da possível toxicidade gerada por tais compostos como no estudo onde foi avaliada a toxicidade e relacionados com a atividade pró-oxidante exibida por estes compostos, quando utilizado em concentrações relativamente elevadas (SANTOS et al., 2009). Os efeitos genotóxicos do DD foram avaliados e foi observado que DD pode induzir genotoxicidade sistêmica em mamíferos, uma vez que provoca danos no DNA em órgãos vitais tais como cérebro, rim e fígado (ROSA et al., 2007). Sendo que nas doses e via de administração aqui utilizada o DD tem se mostrado um composto seguro (PRIGOL et al., 2009).
Finalmente, diante dos nossos resultados e evidências da literatura, podemos dizer que o uso de DD de acordo com a dose utilizada no presente estudo resultou na atenuação do dano cerebral resultante do dano oxidativo e da alteração dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial nos animais submetidos à sepse, resultados esses que foram superiores a utilização de EB.
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados apresentados no presente estudo podemos constatar que:
• O DD exerce um efeito protetor contra o dano oxidativo em lipídios e proteínas em 12 e 24h após os animais serem submetidos à sepse em diferentes estruturas cerebrais sendo de um modo em geral mais efetivo que o tratamento com EB.
• Nos complexos da cadeia respiratória mitocondrial estudados verificamos uma diminuição de suas atividades nos animais submetidos à sepse nos diferentes tempos estudados e novamente o DD pareceu exercer efeito de reversão desses níveis em várias estruturas cerebrais estudadas, no entanto, o mesmo pareceu não ocorrer com EB.
• A atividade da enzima CK foi diminuída nos animais submetidos à sepse em 12 e 24 horas para diferentes estruturas cerebrais estudadas, e apenas foi revertido tais níveis no hipocampo e somente com a administração de DD.
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