Para realização da análise estatística descritiva os resultados foram tabulados em planilha eletrônica1para a obtenção da freqüência da distribuição das variáveis clínicas, radiográficas e laboratoriais.
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Microsoft Office Excel 2007 Microsoft Corporation São Paulo, São Paulo A
IV. RESULTADOS
Dos 154 cães avaliados, 100 foram considerados positivos para infecção por Leishmania sp., sendo 74% por meio de exame sorológico (apêndice A), 88% por exame parasitológico de tecido linfóide (apêndice B) e 62% por ambos os métodos (apêndice C).
A percentagem de ocorrência de co-infecção entre Leishmania chagasi e Ehrlichia canis foi de 45%, e não se observou co-infecção com Borrelia bugdorferiem nenhuma amostra (apêndice D).
Os cães positivos para Leishmania sp. tinham em média 36 meses de idade, sendo a positividade maior na faixa de 12 a 48 meses (Figura 8).
Figura 8. Distribuição (%), segundo a faixa etária em meses, de 100 cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi. (Araçatuba SP, 2009)
Dos 100 animais avaliados, 54% eram machos e 46% fêmeas. Não se observou predisposição racial, com 66% dos cães sem precisa definição racial e 34% com raça definida (Figura 9).
Figura 9. Distribuição em número, segundo a raça, de 100 cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi. (Araçatuba SP, 2009)
Em 83% dos cães detectou-se radiograficamente pelo menos uma lesão articular. As articulações mais afetadas foram as társicas e cápicas, havendo uma tendência para o envolvimento bilateral (Figura 10). Embora esses animais (83/100) representem um total de 664 articulações estudadas, dessas apenas 49,2% demonstraram algum sinal radiográfico digno de nota.
Figura 10. Freqüência (%) do envolvimento articular observada nos exames radiológicos de 100 cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi. Onde URUD representa a articulação úmero-rádio-ulnar direita, RCMD a articulação rádio-cárpica-metacárpica direita, FTFD a articulação fêmuro-tíbio-fibular direita, TTMD a articulação tíbio-társica-metatársica direita, URUE a articulação úmero-rádio-ulnar esquerda, RCME a articulação rádio-cárpica- metacárpica esquerda, FTFE a articulação fêmuro-tíbio-fibular esquerda e TTME a articulação tíbio-társica-metatársica esquerda. (Araçatuba SP, 2009)
As lesões foram caracterizadas por irregularidade do trabeculado ósseo, esclerose subcondral, áreas de osteólise, edema de partes moles adjacentes à articulação, diminuição do espaço interarticular, osteólise associada à proliferação óssea, somente áreas de proliferação óssea, aumento de opacidade medular e fratura patológica (Figuras 11 e 12).
Figura 11. Radiografias das articulações locomotoras distais de cão acometido por leishmaniose visceral, com sinais radiográficos compatíveis com artrite. Visualização do trabeculado ósseo grosseiro (seta branca), esclerose subcondral (seta verde), colapso articular (seta vermelha), osteólise (seta amarela) e osteólise associada à proliferação óssea (seta azul). (Araçatuba SP, 2009)
Figura 12. Frequência (%) dos achados radiográficos observados em articulações de 100 cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi. (Araçatuba SP, 2009)
Devido à dificuldade de obtenção, ao pequeno volume ou à contaminação da sinóvia, a avaliação citológica deixou de ser realizada em 196 das 800 articulações estudadas.
Dos 55 cães positivos para leishmaniose visceral e negativos para erliquiose, 23% (101/440) das amostras de líquido sinovial apresentavam formas amastigotas de Leishmania sp. em macrófagos (Figura 13). As articulações tarsais (33/101) e carpais (26/101) foram as mais comumentes infectadas, seguidas das articulações dos cotovelos (24/101) e dos joelhos (19/101).
A maioria das articulações dos cães com leishmaniose visceral com sorologia negativa para Ehrlichia sp. (75/101) apresentou alteração na contagem diferencial das células, sendo que 30% das amostras analisadas apresentou aumento do número de neutrófilos, estando esses hipersegmentados, a maioria dos quais apresentando sinais de degeneração.
Em 70% das amostras ocorreu aumento do número de células mononucleares ativadas, enquanto 25,75% (26/101) possuiam contagem de células diferenciais dentro do intervalo de referência descrito por Fernandes (2009).
Embora formas amastigotas de Leishmania sp. não tenham sido encontradas em 45% (197/440) das articulações dos cães negativos para erliquiose canina (Figura 13), a contagem diferencial das células apresentou-se elevada em 57% (113/197) das articulações. De modo similar às articulações com presença de formas amastigotas, as não infectadas também apresentaram o mesmo padrão de alteração na contagem diferencial (aumento do número de células mononucleares ativadas e neutrófilos).
Figura 13. Freqüência (%) dos envolvimentos articulares observadas nos exames citológicos do líquido sinovial, de 55 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral e negativos para erliquiose canina. (Araçatuba SP, 2009)
Entretanto, nos animais restantes (45/100), estes positivos para leishmaniose visceral canina e erliquiose canina concomitantemente, 27,2% (98/360) das articulações apresentaram formas amastigotas de Leishmania sp. no líquido sinovial (Figura 14), sendo as articulações carpais (27/98) e tarsais (25/98) as mais comumente acometidas, seguidas das articulações dos joelhos (23/98) e dos cotovelos (23/98).
Em 69,4% (68/98) das amostras de líquido sinovial com a presença do parasito ocorreu aumento da celularidade, sendo 63,23% (43/68) por neutrófilos, e esses hipersegmentados, 51,47% (35/68) com predomínio de células mononucleares, enquanto 30,6% (30/98) das articulações encontravam- se dentro dos padrões de normalidades quanto à celularidade (FERNANDES, 2009).
De um total de 207 articulações de cães sorologicamente positivos para Ehrlichia sp e sem a presença de formas amastigotas de Leishmania sp., 41% (85/207) apresentaram aumento de celularidade, sendo que 62,35% (53/85) tinham predomínio de células mononucleares e 37,65% (35/85) de neutrófilos, e esses hipersegmentados. As alterações citológicas da sinóvia das articulações carpais representaram 18/85 (21,2%), as tarsais 22/85 (25,9%), joelhos 24/85 (28,3%) e os cotovelos por 21/85 (24,7%).
Figura 14. Freqüências (%) dos envolvimentos articulares observadas nos exames citológicos do líquido sinovial, de 45 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral e positivos para erliquiose canina. (Araçatuba SP, 2009)
Quando somados os achados da avaliação sinovial dos distintos grupos, percebeu-se que 24,87% (199/800) das articulações estavam parasitadas por formas amastigotas de Leishmania sp. (Figura 15), enquanto 50,63% (405/800) das articulações tinham ausência do parasito e 24,5% (196/800) apresentavam contaminação sanguínea ou material insuficiente para análise. Das 199 amostras de líquido sinovial em que se identificaram formas amastigotas de Leishmania sp., 56 (28,14%) possuíam citologia normal e 143 (71,85%) alterada. Da mesma forma em situações em que o líquido sinovial não estava parasitado 51% (206/404) estavam dentro dos limites de normalidade e 49% (198/404) apresentavam-se anormais.
Figura 15. Avaliação citológica de líquido sinovial de cão acometido por leishmaniose visceral. Imagens com intensa neutrofilia (seta vermelha), linfócitos (seta verde), macrófago (seta preta) fagocitando forma amastigota de Leishmania sp. (seta azul), coloração panótica, aumento de 400X (A) e 1000X
(B). (Araçatuba SP, 2009)
V. DISCUSSÃO
Neste estudo, 88% (88/100) dos animais foram positivos por meio da citologia aspirativa por agulha fina (CAAF) de linfonodos, valor este superior aos 57,30% (51/89) de positividade em cães naturalmente infectados provenientes de área endêmica para leishmaniose visceral relatados por Moreira et al. (2007). Slappendel & Ferrer (1990) descrevem que a prevalência da LV em cães de áreas endêmicas pode atingir entre 20 e 40% da população, diferindo de Ferrer (2002) que relata uma prevalência de cães infectados superior a 50%. Segundo Albuquerque et al. (2005), no Brasil, a prevalência em áreas endêmicas pode chegar a 46,6%, valores esses bem inferiores à taxa de positividade (74%) encontrada no presente estudo por meio da técnica de ELISA. A avaliação citológica de linfonodo, para a investigação direta de formas amastigotas de Leishmania chagasi também tem sido empregada como outra técnica de diagnóstico para a enfermidade. Por se tratar de um estudo clínico e não epidemiológico, como os supracitados, é provável que esta maior positividade deva-se ao fato da amostragem ter sido intencional, selecionando- se cães do CCZ e, portanto, com maior probabilidade de serem portadores de LV. Esta deve ser também a razão pela qual um maior número de positividade foi obtido pela CAAF do que pelo método de ELISA.
Com relação à predisposição etária, a maior parte dos animais apresentava idade entre 12 e 24 meses (45%) e 25 e 48 meses (30%), confirmando os achados descritos por Sonoda (2007) e Miranda (2008), que referem maior casuística em cães adultos jovens. Esses achados conflitam com Ferrer (1992), Noli (1999) e Feitosa et al. (2000) que não evidenciaram predisposição quanto à faixa etária.
No que tange à predisposição sexual, no presente estudo não houve predisposição sexual para LV, corroborando com os relatos de Ferrer (1992), Noli (1999), Feitosa et al. (2000), Sonoda (2007) e Miranda et al. (2008).
Quanto à predisposição racial, o presente ensaio constatou que 66% (66/100) dos cães com leishmaniose visceral não apresentavam precisa definição racial e 34% (34/100) tinham raça definida, divergindo dos relatos de Sonoda (2007) que descreve uma casuística de 66,7% da doença em animais de raça pura, tais como Poodle (20,8%), Labrador (20,8%), Boxer (12,5%), Chow-Chow (8,3%) e Teckel (8,3%). Esses dados tornam-se conflitantes, pois a autora avaliou apenas 36 cães domiciliados e provenientes de um hospital escola. No presente estudo os animais eram, em sua maioria, errantes e provenientes do Centro de Controle de Zoonoses.
No presente estudo, 38% dos animais apresentavam quadros clínicos compatíveis com artrite ou poliartrite, concordando com os achados de Agut et al. (2003), que ao avaliarem 58 cães de área endêmica para Leishmania sp., descreveram que 44,8% apresentavam distúrbios osteoarticulares. Alterações ortopédicas têm sido descritas como incomuns em cães com leishmaniose visceral, segundo Kontos & Koutinas (1993), fato também demonstrado por Feitosa et al. (2000), que relataram o envolvimento locomotor em apenas nove animais de 215, o que difere de Turrel & Pool (1982) e Slappendel (1988), onde observaram alterações em 30% dos casos.
No presente estudo, dos 100 cães com leishmaniose visceral, 83 (83%) apresentaram alterações osteoarticulares à avaliação radiográfica, o que difere dos resultados encontrados por Agut et al. (2003), que relataram a presença de osteoartrite em 57,7% dos animais portadores de leishmaniose visceral. Acredita-se que a presente discordância pode ter sido observada, uma vez que os autores utilizaram uma amostragem inferior e apenas examinaram animais sintomáticos. No Brasil, alterações locomotoras em cães infectados por Leishmania chagasi foram descritas por Bevilacqua et al. (2002), Souza et al. (2005), Santos et al. (2006), Silva et al. (2007a), Silva et al. (2007b), Silva et al. (2007c) e Paraboni et al. (2008). Entretanto, não foi possível confrontar tais relatos com os nossos resultados, no que diz respeito à freqüência de ocorrência, uma vez que os mesmos relataram caso clínico de um único animal.
Por meio da avaliação radiográfica verificou-se um envolvimento das articulações de forma bilateral e com maior freqüência nas junções distais: tíbio-társica-metatársicas (társicas) com 75% (75/100) e rádio-cárpica- metacárpicas (cárpicas) esquerda e direita com 54% (54/100) e 52% (52/100) respectivamente, corroborando os achados de Turrel & Pool (1982), Buracco et al. (1997), Agut et al. (2003), Santos et al. (2006), Silva et al. (2007a), Silva et al. (2007b) e Silva et al. (2007c). Com menor freqüência observou-se o acometimento das articulações úmero-rádio-ulnar (cotovelo) esquerda e direita, com 26% (26/100) e 24% (24/100) respectivamente, e finalmente as fêmuro- tíbio-fibular (joelho) esquerda com 11% (11/100) e a direita com 10% (10/100), com comportamento semelhante às articulações distais, quando do envolvimento bilateral. Estes resultados se assemelham aos encontrados por Turrel & Pool (1982), Spreng, 1993, Wolschrijn et al. (1996), Agut et al. (2003), Souza et al. (2005). Provavelmente esse achado deve-se à conformação articular, pois essas articulações são maiores e menos complexas quando comparadas com as distais supracitadas. Há de se considerar que as diferenças hemodinâmicas possam também colaborar para maior comprometimento das articulações distais, a semelhança do que ocorre com os hemoparasitos que são mais facilmente encontrados em amostra de sangue periférico.
Alterações radiográficas como osteólise periosteal foram observadas em 18,12% das articulações, semelhante ao descrito por Wolschrin et al. (1996), Koutinas et al. (1999), Blavier et al. (2001), McConkey et al. (2002) e Agut et al. (2003), sugerindo que esses animais encontravam-se em uma fase avançada da doença. Entretanto, também foram observadas áreas de lise óssea associadas a processos proliferativos ósseos em 3,98% das articulações e proliferação óssea periosteal em 2,65%, resultados também reportados por Buracco et al. (1997), que sugerem ser incomum esses achados e podem ser interpretados como resultado de uma infecção crônica. Diferentemente, Agut et al. (2003), observaram maior freqüência de sinais radiográficos de proliferação
óssea e periosteal por terem selecionado em seu estudo um maior número de cães com quadro agudo ou subaguda da doença.
Alterações radiográficas como trabeculado ósseo grosseiro e esclerose subcondral também foram observadas em 28,62% e 20,77% das articulações, respectivamente, podendo ser interpretadas como uma evidência de infecção inicial, segundo Turrel & Pool (1982). O aumento de opacidade do canal medular foi observado em um dos casos estudados, fato observado também por Turrel & Pool (1982) e Agut et al. (2003), que associaram esta alteração com a infecção por via hematógena. Ocorrências como edema de partes moles (12,93%) e colapso articular (12,71%), também foram encontradas no presente ensaio, conforme observado em estudos pretéritos relatados por Turrel & Pool (1982), Yamaguchi et al. (1983), Cucinotta et al. (1991), Spreng (1993), Wolschrin et al. (1996), Buracco et al. (1997) e Silva et al. (2007a), fato associado a uma possível infecção sinovial.
Neste estudo, as amostras de líquido sinovial apresentaram baixo volume e a com contagem diferencial de células nucleadas fora o teste usualmente realizado, bem como a pesquisa direta de formas amastigotas de Leishmaniasp., limitação também descrita por Agut et al. (2003) e associada à dificuldade de colheita.
A visualização do parasito em macrófagos no líquido sinovial já havia sido relatada por Yamaguchi et al. (1983), Spreng (1993) e Buracco et al. (1997), o que corrobora com os resultados do presente estudo, onde 24,87% (199/800) das articulações foram positivas para a presença de Leishmania sp. O aumento anormal do número de neutrófilos no líquido sinovial de cães com leishmaniose visceral também foi observado por Cuccinota et al. (1991), Spreng (1993), Buracco et al. (1997) e Agut et al. (2003), em conformidade com os resultados aqui demonstrados, onde 71,85% (143/199) das amostras apresentaram neutrofilia e presença do protozoário. Alteração de celularidade indicando inflamação também ocorreu em 49% (198/404) das amostras de líquido sinovial sem a presença de formas amastigotas de Leishmania sp. Contudo, deve-se levar em consideração que a não visualização de formas
amastigotas de Leishmania sp. no líquido sinovial não exclui a infecção, sendo importante a realização de outras técnicas de diagnóstico mais sensíveis, a exemplo da reação em cadeia de polimerase e a imunohistoquímica. Corroborando propostas para a patogênese da poliartrite associada à leishmaniose visceral canina que segundo Agut et al. (2003) a poliartrite ocorre como conseqüência de uma inflamação granulomatosa da sinóvia causada pela presença da leishmania ou pela deposição de imunocomplexos na sinóvia, levando a uma sinovite e poliartrite, segundo Cucinotta et al. (1991) e Ferrer (1992).
VI. CONCLUSÃO
1. As alterações radiográficas de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. são difusas, bilaterais, predominantemente distais, porém não patognomônicas.
2. As lesões osteoarticulares de cães com leishmaniose visceral são predominantemente do tipo erosiva, sugerindo cronicidade do processo. 3. A maioria das alterações radiográficas articulares de cães acometidos
por leishmaniose visceral não estão associadas à presença do parasito na sinóvia, sugerindo que a etiopatogenia das lesões articulares não é devida exclusivamente à presença do parasito.
4. As alterações citológicas do líquido sinovial não contribuíram para o diagnóstico da poliartrite causada por leishmaniose visceral, enquanto a pesquisa da forma amastigota de Leishmania sp. na sinóvia mostrou-se uma boa alternativa para o diagnóstico da doença, especialmente em cães portadores de alterações clínico-radiográficas do carpo e tarso.
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