A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa SigmaStat 2.0 (Jandel Scientific, San Rafael, CA) e os gráficos foram elaborados por auxilio do Programa Sigma-Plot 4.0. Foi considerada diferença significativa quando o valor de p foi menor que 0,05.
Para as am
5 RES LTADOS
om o objetivo de validarmos as medidas da freqüência de batimento ciliar (FBC) neste modelo, realizamos medidas antes e após a inalação de
solução salina 0,9% (SALINA), acetilcolina (Ach 10-3M) e capsaicina (CAPS
3.10-3M), uma substância cilioexcitatória conhecida, em animais naïve
(Figura 11). Observamos que o método aplicado na mensuração da FBC é
adequado, já que observamos que a inalação com capsaicina 3.10-9M por 5
minutos aumentou a FBC (p < 0,05) comparada ao valor basal (Controle positivo), comportamento não observado após a inalação de solução salina 0,9% e acetilcolina na concentração de 10-3 M.
comparação entre os valores basais de FBC dos animais controle (CONTROLE) e animais com inflamação de vias aéreas (OVA) (n=28 em cada grupo) não mostrou diferença estatisticamente significativa (p=0,792), e a média de ambos foi de aproximadamente 16 Hz (Figura 12).
U
C
Figura 11 - Valores (médias ± erro padrão) da Freqüência de Batimento Ciliar (FBC), basais e após inalação de solução salina 0,9% por 15 minutos, de acetilcolina na concentração de 10-3 M por 15 minutos e capsaicina 3.10-9M
F CONTROLE OVA 5 10 15 20 FBC (H z )
igura 12 - Valores basais (médias ± erro padrão) da Freqüência de Batimento Ciliar (FBC), de animais controle e com inflamação de vias aéreas (OVA).
SALBUTAMOL SALBUTAMOL 3.5.10-3M 3.5.10-4M
CONT OVA CONT OVA
FB C (H z ) 5 10 15 20 BASAL APÓS AEROSOL
Ao analisarmos os animais controle (CONT) e com inflamação crônica de vias aéreas (OVA), notamos que a inalação de salbutamol nas
concentrações de 3,5.10 –3 M e 3,5.10 –4 M mostrou um aumento
estatisticamente significativo na freqüência de batimento cilia tanto nos animais controle quanto nos animais com inflamação de vias aéreas (p < 0,05, Figura 13).
Figura 13 - Valores (médias ± erro padrão) basais e após inalação de salbutamol nas concentrações de 3,5.10-3 M e 3,5.10-4 M, da freqüência de batimento
ciliar (FBC) de animais controle e com inflamação de vias aéreas (OVA) (* p<0,05).
*
*
*
*
Figura 14 - Valores (médias ± erro padrão) da Freqüência de Batimento Ciliar (FBC), de animais controle e com inflamação de vias aéreas (OVA), basais e
A inalação de Brometo de Ipratrópio nas concentrações de 10-4 M e
6.10-4 M não alteraram a freqüência de batimento ciliar (Figura 14).
BASAL
após inalação de ipratrópio nas concentrações 10-4 M e 6.10-4 M.
IPRATROPIO IPRATROPIO 10-4M 6.10-4M
CONT OVA CONT OVA
F BC ( Hz) APÓS AEROSOL 4 8 12 16
Em relação à medida da diferença de potencial transepitelial, o grupo OVA apresentou aumento significativo nos valores basais de PD na traquéia comparativamente aos animais do grupo CONTROLE (p=0,013) (Figura 15).
Figura 15 - Média dos valores da diferença de potencial transepitelial medidos na traquéia de camundongos controle e sensibilizados com ovoalbumina (OVA)
(*p = 0,013).
OVA CONTROLE OVA
As fotomicrografias de microscopia eletrônica de traquéia de camundongos do grupo controle e do grupo OVA mostram a preservação das tight junctions nos grupos estudados(Figuras 16 e 17).
PALATO TRAQUÉIA
PD
(m
V)
-25 -20 -15 -5 -4 -3 -2 -1 0*
CONTROLE OVAPALATO TRAQUÉIA
PD
(m
V)
-25 -20 -15 -5 -4 -3 -2 -1 0jun ão crônica de vias aéreas.
Figura 17 - Fotomicrografias de microscopia eletrônica mostrando as tight ctions (seta) em traquéia de camundongo do grupo com inflamaç
A figura 18 apresenta a análise celular do lavado broncoalveolar realizado nos animais do grupo CONTROLE e do grupo OVA. O grupo OVA apresentou maior número de eosinófilos, quando comparado aos animais do grupo CONTROLE. Isso indica a presença de significante resposta inflamatória pulmonar nos animais do grupo OVA no momento das medidas de freqüência de batimentos ciliar e da diferença de potencial transepitelial.
Figura 18 - Contagem do número de células inflamatórias presentes no lavado broncoalveolar
NEUTRÓFILOS EOSINÓFILOS LINFÓCITOS MACRÓFAGOS
CÉ LUL A S ( x 10 6 /m L) 0 1 2 3 4 5
*
*
CONTROLE OVAAs figuras 19, 21 e 23 mostram a morfometria da superfície do epitélio respiratório realizadas no nariz (região do septo), traquéia e vias aéreas distais.
Figura 19 -
células secretoras e mucinas ácidas mparado ao grupo
Os animais do grupo OVA apresentam um aumento significativo de na cavidade nasal co CONTROLE(* p<0,001). muco áci do muco neu tro cél c iliada cél se cret ora Den s id ad e (% ) 25 50 75 100 CONTROLE OVA
*
*
*
Gráfico 1 - Gráfico 2 - Gráfico 3 - Gráfico 4 - Gráfico 17 - Gráfico 18 - fico 20 -
Figura 20 - Fotomicrografias de microscopia óptica da cavidade nasal de camundongos (coloração PAS/AB) (aumento de 1000X) dos grupos controle
Gráfico 5 - Gráfico 6 - Gráfico 7 - Gráfico 8 - Gráfico 9 - Gráfico 10 - Gráfico 11 - Gráfico 12 - Gráfico 13 - Gráfico 14 - Gráfico 15 - Gráfico 16 - Gráfico 19 - Grá
A
B
Os animais OVA apresentam um aumento significativo de células secretoras e mucinas neutras na traquéia comparado ao CO
(* p<0,001). Figura 21 - NTROLE muco áci do muco neutr o cél c iliada cél sec ora Den sidad e ( % ) 0 25 50 75 100 SALINA OVA
*
*
*
retGráfico 21 - Gráfico 22 - Gráfico 34 - Gráfico 35 - Gráfico 36 - Gráfico 38 -
Figura 22 - Fotomicrografias de microscopia
(coloração PAS/AB) (aumento de 1000X) dos
Gráfico 23 - Gráfico 24 - Gráfico 25 - Gráfico 26 - Gráfico 27 - Gráfico 28 - Gráfico 29 - Gráfico 30 - Gráfico 31 - Gráfico 32 - Gráfico 33 - Gráfico 37 -
A
B
óptica de traquéia de camundongos grupos controle (A) e com
Os animais OVA apresentam um aume
Figura 23 - o de células
secretoras e mucinas ácidas e neutras nas vias aéreas distais comparado ao CONTROLE (* p<0,00 nto significativ 1). muco ácid o mu co ne utro cél c iliada cél s ra De ns idade (%) ecr eto 25 50 75 100 SALINA OVA
*
*
*
*
Figura 24 - Fotomicrografias de microscopia óptica de tecido pulmonar de camundongos (coloração PAS/AB) (aumento de 200X) dos grupos controle
(A) e com inflamação crônica de vias aéreas (B).
A
Observamos também nas Fotomicrografias da cavidade nasal (F
20), traquéia (Figura 22) e de vias aéreas distais (Figura 24) de camundongos dos grupos controle (A) e submetidos ao protocolo de
igura
sensib zação por ovoalbumina (B), coradas pela combinação de ácido periódico de Shiff (PAS) e Azul Alciano (AB) (pH 2,5), sinais sugestivos de hiperplasia/hipertrofia de células secretoras e aumento de mucinas armazenadas, predominantementes AB+ na cavidade nasal enquanto que nas vias aéreas distais a maioria são PAS+.
6 DISCUSSÃO
iversos estudos têm sido feitos no sentido de desenvolver formas de
avaliar o transporte mucociliar através de modelos experimentais. No
entanto, esses experimentos são realizados em sua maioria in vitro, em
cultura de células epiteliais ciliadas, sobre o epitélio ciliado de palato de rã
ou em vias aéreas de animais in situ. (Stewart, 1948, Sade e cols, 1970 e
1975; King e cols, 1974; Lopez-Vidriero, 1985; Negri e cols, 1987; Festa e cols, 1985a, 1985b, 1987, 1996a, 1996b; Lorenzi e cols, 1992; King e cols, 1998; Macchione e cols 1998, Agu 1999; Frohock 2002).
osso intuito inicial foi desenvolver um modelo experimental in vivo
para investigação do transporte mucociliar em um modelo animal de asma, capaz de permitir mensurações em um animal pequeno frente inalação de drogas. Além disso, poucos foram os trabalhos que estudaram de forma
sistemática o transporte mucociliar em modelos experimentais de asma in
vivo (Wanner e cols, 1975) ou frente à inalação de medicamentos utilizados
na terapêutica da asma (Iravani e cols, 1972; As e cols, 1974; Sackner e cols, 1977; Verdugo e cols, 1980; Hybbinette e cols, 1982; Hybbinette e cols, 1982; Devalia e cols, 1992; Wong e cols, 1988).
Optamos pela utilização de camundongos por serem animais de pequeno porte, baixo custo e de fácil manutenção e serem animais de escolha para o estudo da asma devido a proximidade com a doença em seres humanos, incluindo produção de anticorpos específicos IgE, aumento de mastócitos, de linfócitos T e infiltrado tecidual eosinofílico, citocinas Th2,
D
e hiperresponsividade a broncoconstritores não específicos (Khai e cols 2001; Kips e cols 2003).
o por apresentar maior
spiração espontânea por aproxi
Para produzir o modelo, um antígeno é injetado via parenteral para induzir uma sensibilização sistêmica e o mesmo antígeno é administrado pelas vias aéreas (via nebulização ou colocação pela cavidade nasal), o foco do processo inflamatório.
Os camundongos mais utilizados nesses estudos são os BALB/c e C57BL/6 por apresentarem maior responsividade de vias aéreas.
No entanto, após estudo piloto utilizando as linhagens de
camundongos BALB-c e Swiss, optamos por este últim
tamanho (até 50 g) o que possibilitou melhor visualização da traquéia para a mensuração da FBC e PD. Além disso, realizamos um estudo piloto utilizando o protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar por ovoalbumina, modificada de Kasahara e cols 2004 e nos certificamos da resposta inflamatória nesses animais ao observarmos eosinofilia no lavado broncoalveolar e broncoconstrição e recrutamento de células inflamatórias no tecido pulmonar, observados por microscopia ótica.
Após a escolha do animal, iniciamos a procura por um anestésico que fosse capaz de manter o animal em re
madamente 30 minutos, e que não causasse depressão no aparelho mucociliar. Realizamos estudos com a utilização de Hypnol 3% (pentobarbital sódico) 70 mg/kg, por via intraperitoneal; tiopental sódico, 50
e 40 mg/kg, respectivamente, por via intramuscular, que foram escolhidas por apresentarem o efeito desejado por até 60 minutos.
citatória conhecida. o de 3.10- 9 M. R de sensibilização, compa
Para nos certificarmos do estabelecimento do modelo de mensuração
da freqüência de batimento ciliar in vivo e demonstrarmos a responsividade
do mesmo, realizamos a inalação de capsaicina em animais naïve, uma
substância de ação cilioex
A capsaicina foi demonstrada por Wong e cols (1990) aumentar a
FBC em traquéia de cães in vivo quando inalados na concentraçã
esultados similares foram obtidos em nosso modelo na mesma concentração (Controle Positivo).
Assim, nosso estudo demonstrou que é possível mensurar in vivo, em
traquéia de camundongos, a freqüência de batimento ciliar, componente do
transporte mucociliar, que em média mostrou-se 16 Hz. A observação
limitou-se aos primeiros 15 minutos após a exposição da traquéia e/ou após a inalação de drogas, para que não houvesse interferência do tempo de exposição nas medidas.
Em seguida, após concluirmos o protocolo
ramos a FBC basal dos animais controle e com inflamação pulmonar alérgica crônica. Podemos dizer que a disfunção mucociliar neste modelo animal de asma não é causada por uma queda da freqüência de batimento ciliar, uma vez que não há diferença estatisticamente significativa na FBC entre o grupo controle e o grupo sensibilizado.
Estudos realizados com β2–agonistas bastante utilizados no
tratamento da asma tem demonstrado que estes agentes são potentes bronco
receptores β adrenérgicos, e as célu
a
agonista de curta ação estudado, o salbuta
ol na concentração de 10-4 M aumentou a FBC in
vitro e
dilatadores e, além disso, podem exibir propriedades como a inibição de mediadores inflamatórios, atenuação da reatividade das vias aéreas e aumento do transporte mucociliar. As células da superfície epitelial das vias aéreas e as glândulas submucosas expressam
las ciliadas do epitélio respiratório, bem como as células mucosas e serosas das glândulas submucosas podem responder a estimulação β-
gonista pela produção de AMP cíclico (Lazarus, 1984 e Barne, 1983).
Em nosso estudo, o β2
mol, nas concentrações de 3,5.10–4 M e 3,5.10–3 M elevou a
freqüência de batimento ciliar nos animais controle e também nos animais com inflamação de vias aéreas. O aumento da FBC exprime a velocidade das ondas metacronais de cílios que se movem sobre o epitélio, auxiliando o transporte mucociliar. Esses achados concordam com os de Devalia e cols (1992), em que o salbutam
m cultura de células epiteliais brônquicas de seres humanos, do nível basal de 8,6 + 0,4 para 9,6 + 0,5 Hz após 2 horas de incubação. Os mesmos
autores também estudaram o transporte mucociliar in vitro, em cultura de
células epiteliais brônquicas de pacientes que se submeteram à cirurgia pulmonar, após exposição aos β adrenérgicos salbutamol e salmeterol. O
salbutamol na concentração de 10-4 M causou um transitório, mas
A estimulação da FBC pelos β-agonistas provavelmente se deve a ativação da proteína cinase A (PKA) por uma cascata de sinalização envolvendo receptores β-agonistas, adenil ciclase e AMPc e o mecanismo molecular pelo qual a PKA aumenta a FBC em mamíferos é análoga a estimulação da atividade ciliar em Paramecium.
Hamasaki e cols, 1989 e 1991, mostraram que PKA fosforilada aumenta a velocidade de deslizamento do microtubulo através da camada
de dineína in vitro e aumenta a velocidade de natação do Paramecium in
vivo.
Em nosso estudo, o brometo de ipratrópio nas concentrações de 10-
4
M e 6.10-4M não alterou a FBC, tanto em animais controle como em animais
com inflamação alérgica crônica de vias aéreas. Vários estudos têm mostrado que uma administração única de brometo de ipratrópio (dose de
160 μg) ou administrações em longo prazo (dose de 200 μg por dia)
falharam em deprimir o transporte mucociliar em indivíduos normais e em pacientes com asma ou bronquite crônica (Borum e cols, 1979, Pavia e cols 1979, Pavia, e cols 1980, Ruffin e cols 1978, Konietzko e cols 1974, Francis
e cols 1977). No estudo de Iravani 1972, o ipratrópio na concentração de 10-
3
g/ml, mostrou deprimir minimamente a freqüência de batimento ciliar, menos que 20% em via aérea de ratos.
As células epiteliais da vias aéreas regulam a profundidade do fluído periciliar pelo transporte ativo de Na+ e Cl- e desempenham importante papel no transporte mucociliar. Diariamente essas células são bombardeadas por poluição, antígenos estranhos, agentes nocivos e
microo
ção de eletrólitos (Yang e cols, 2
Nos animais sensibilizados com ovoalbumina foi observada macro
lho com o azul alciano em pH 2,5 e PAS in
rganismos. Em resposta a esses inúmeros estímulos, o epitélio das vias aéreas tem liberado citocinas inflamatórias e pro inflamatórias e quimiocinas. As citocinas liberadas por células residentes e recrutadas nas vias aéreas como Interleucina 4, Interleucina 13 e Interferon γ produzem mudanças na função de barreira epitelial e secre
002) e juntamente com os fatores de crescimento liberados pelas células epiteliais das vias aéreas contribuem para o processo de reparação e remodelamento observado na asma (Holgate e cols, 2003).
scopicamente grande quantidade de muco respiratório após a abertura da traquéia. Para que os mesmos sobrevivessem durante o procedimento de mensuração da FBC a secreção foi aspirada através de uma seringa conectada a um cateter, sempre na região distal da abertura e sem que o epitélio fosse perturbado. Esta secreção de muco pode ser observada através das fotomicrografias da cavidade nasal, traquéia e tecido pulmonar na coloração PAS-AB. A seqüência PAS-AB cora as substâncias ácidas do muco em azul e as neutras em vermelho. Os polissacarídeos ácidos corados em azul ou púrpura no pH de 2,5 incluem o ácido hialurônico, sialomucinas e quase todas as muco-substâncias sulfatadas mais fortemente ácidas; os mucopolissacarídeos corados em verme
cluem muco-substâncias neutras e algumas acidófilas mascaradas (Jones e cols 1973).
armazenamento do muco, além de mucinas predominantementes AB+ na cavidade nasal enquanto que nas vias aéreas distais a maior parte é constituída de PAS+.
Em relação às propriedades bioelétricas do epitélio respiratório, as medidas da diferença de potencial transepitelial são utilizadas para estudar a integridade da membrana epitelial das ligações entre as células do epitélio, como por exemplo, as junções intercelulares do epitélio respiratório, além de mostrar a capacidade do epitélio na regulação dos fluídos (Knowles e cols, 1981;
exposto ao protocolo de sensibilização e indução da inflama
Welsh, 1987). A abertura das junções intercelulares do epitélio respiratório pode permitir que os antígenos atinjam a musculatura e a lâmina própria com maior facilidade. As fotomicrografias de microscopia eletrônica da traquéia dos animais mostraram que as junções intercelulares encontravam-se íntegras neste modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica.
Nosso modelo permitiu estudar in vivo a diferença de potencial
transepitelial no epitélio traqueal de camundongos com inflamação de vias aéreas induzida por ovoalbumina (OVA). Para validarmos a mensuração da PD traqueal, durante o protocolo, mensuramos a PD no palato e língua do animal, que sabidamente é bastante negativa, e não houve diferença significativa entre os dois grupos.
Verificamos que a PD medida no epitélio traqueal estava diminuída nos animais do grupo
ção pulmonar por ovoalbumina (p = 0,013), sendo esses resultados semelhantes aos do estudo de Cloutier 2004, que demonstrou uma menor
diferença de potencial transepitelial (PD), corrente de curto circuito e resistência do tecido em cultura de células traqueais de camundongos (C57BL/6J) sensibilizados à ovoalbumina (OVA) com períodos de inflamação de 3 d
doença alérgica das vias aéreas, e podem facilitar a retenção de muco
, que podem estar com suas propriedades reológ
ias de aerossol (OVA-3) e 10 dias (OVA-10), em comparação a células epiteliais de animais naive. As cultura de células dos camundongos sensibilizados mostrou ainda maior inibição na absorção de sódio em resposta ao amiloride. Na presença da rede de absorção do cloreto, o aumento na absorção de sódio observado na cultura de células dos animais OVA-10 pode resultar em diminuição do deslocamento de água para a luz das vias aéreas levando à desidratação do muco.
As mudanças observadas na PD associadas à não elevação da freqüência de batimento ciliar no grupo com inflamação de vias aéreas, representam uma importante característica do estado alérgico neste modelo murino de
resultando em um epitélio com características similares ao observado nas vias aéreas de fibrose cística (Zabner e cols, 1998).
As células epiteliais podem ter um papel não apenas na homeostase mas também na geração e manutenção da inflamação da via aérea. A liberação de mediadores inflamatórios na asma determina aumento da secreção de mucinas respiratórias
icas alteradas reduzindo a eficiência do batimento ciliar e portanto, a habilidade do sistema mucociliar de retirar do local agentes patogênicos e
Durante a realização deste estudo procuramos desenvolver um processo para a medida do transporte mucociliar neste modelo, através da determinação da taxa de deslocamento de partículas na traquéia com a utilização de um microscópio óptico contendo uma lente reticulada. No entanto, após a experimentação de micropartículas de grafite, plástico, alumínio, gel e corante concluímos que este modelo não mostrou-se apto para esta medida.
Este estudo confirma o papel do epitélio das vias aéreas no modelo de inflamação pulmonar induzido por ovoalbumina e oferece a possibilidade de investigar detalhadamente os mecanismos pelos quais as mudanças no transporte de membrana ocorrem e a interação entre o epitélio das vias aéreas e outras células pulmonares no desenvolvimento e perpetuação da inflamação das vias aéreas.
7 CONCLUSÕES
) Nosso estudo demonstrou que é possível desenvolver um modelo experimental em traquéia de camundongos com e sem inflamação de vias aéreas para o estudo in vivo da freqüência de batimento ciliar.
) Não há diferenças significativas na freqüência de batimento ciliar de camundongos controle e com inflamação de vias aéreas. No entanto, a diferença de potencial transepitelial no epitélio traqueal diminui neste modelo de inflamação de vias aéreas induzido por ovoalbumina.
) O salbutamol aumenta a freqüência de batimento ciliar in vivo em
traquéia de camundongos controle e com inflamação de vias aéreas e o ipratrópio não altera a FBC nesses grupos.
1
2
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