Análise Estatística dos Dados

A significância dos resultados foi analisada utilizando análise de variância e teste de Tukey (ARMITAGE et al., 2002) de acordo com Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 para Windows 98. As diferenças entre os insetos tratados e os do grupo controle foram considerados estatisticamente sem significância quando p > 0,05. Intervalos de confiança (IC)

e Relações de Probabilidades (RPS) também foram utilizados. As diferenças entre os grupos tratados e controle foram considerados estatisticamente significativos quando RPs e 95% dos IC foram > 1,0.

3.4.1.3 Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus

As colônias dos insetos O. fasciatus e D. peruvianus (Figura 14 A e B) foram estabelecidas no Laboratório de Biologia dos Insetos da Universidade Federal Fluminense (UFF), sob a coordenação da professora Drª. Maria Denise Feder.

Figura 14 - A: Ninfa de 4º e 5º estágio e adulto de O. fasciatus. B: Adultos de D. peruvianus Fonte: Fernandes (et al., 2013)

Os insetos da espécie D. peruvianus foram mantidos a uma temperatura média que varia entre 20-25ºC, 75% de umidade relativa e fotoperíodo de 16h luz e 8h escuridão (MILANO et al., 1999). Os insetos foram mantidos em cubas de vidro transparente, cobertas com tecido do tipo filó e alimentados com sementes de algodão (Gossypium hirsutum). Os insetos tiveram livre acesso à água armazenada em bebedouros dentro das cubas. Durante os períodos de cópula e postura, as sementes foram mantidas no interior das cubas, até o 1º instar. Contudo, a partir do segundo instar, os insetos foram transferidos semanalmente para cubas limpas e as sementes colocadas sobre o filó, para que o processo de limpeza e manutenção da colônia seja facilitado (STANISÇUASKI et al., 2005). Dentro das cubas de vidro, é utilizado papel filtro para forrar a cuba (cortado em formato circular) e para aumentar a área de movimentação dos insetos (cortado em formato retangular e dobrado para se tornar sanfonado). Para facilitar o processo de postura pelas fêmeas, bem como o da coleta dos ovos,

placas de Petri são colocadas no fundo das cubas, e no interior destas placas gazes ou algodão que são recolhidos de dois em dois dias e transferidos para uma cuba limpa e sem nenhum inseto, contendo apenas sementes e o frasco com água.

Oncopeltus fasciatus foram mantidos sob condições similares àquelas de D. peruvianus a uma temperatura de 20-25ºC (FEIR; BECK, 1963), com umidade relativa de 70- 75% e um fotoperíodo de 16h de luz e 8h de escuridão, alimentados com semente de girassol (Helianthus annus). Todos os experimentos são conduzidos em uma incubadora à temperatura constante de 25ºC. São utilizadas ninfas de 4º instar durante o processo de aplicação do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba. Os testes foram realizados por meio de aplicação tópica, seguindo a metodologia descrita por Fernandes e colaboradores (2013), onde o óleo essencial foi aplicado nos insetos, em diferentes diluições (Figura 15).

O óleo essencial das folhas de Zanthoxylum tingoassuiba, foi utilizado puro e em diluições de 500, 250, 125, 62,5 e 31,2 μL/mL utilizando-se acetona como solvente, para avaliação nos dois insetos. Durante o procedimento os insetos foram segurados com o auxílio de uma pinça entomológica e as amostras aplicadas por intermédio de uma seringa Hamilton (10 μL). Os insetos do grupo tratado com solvente receberam volume igual de acetona sobre a cutícula dorsal. Os insetos do grupo não-tratado não sofreram qualquer espécie de tratamento ou manipulação.

Figura 15 - Ninfas de 4º estágio de Oncopletus fasciatus durante o processo de aplicação da amostra

Fonte: Xavier, 2010

A avaliação do efeito biológico nas diferentes dosagens foi realizada durante todo o tempo necessário para o desenvolvimento do inseto a partir do 4º instar até a fase adulta, ou seja, um período de 28 dias de observações diárias. Durante todo o período de experimentação, foram registrados peso (ganho de peso e crescimento corpóreo) e toxicidade (i.e. mortalidade durante as primeiras 24 horas imediatamente após o tratamento tópico e

durante os 28 dias de observações), período de intermuda (intervalo), muda e metamorfose, ninfas permanentes (ninfas que mudaram para um determinado estádio de desenvolvimento no qual estacionaram, deixando de realizar mudas logo em seguida), ninfas extranumerárias (ninfas que mudaram para um 6 º estádio anormal no ciclo de desenvolvimento dos insetos) e deformidades corporais dos insetos. Todos os tratamentos com as diluições do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba foram realizados em quadriplicata com grupos de 30 insetos, retirados das colônias aleatoriamente, totalmente ingurgitados, sendo este número considerado o número total de insetos (n = 30 em cada grupo da quadriplicata) a partir do dia que sucedera a aplicação tópica do óleo essencial em ninfas de 4º instar (1º dia) até o último dia de observação (28º dia).

3.4.1.4 Análise Estatística dos Dados

A significância dos resultados foi analisada por ANOVA e teste de Tukey, de acordo com o programa “Direct Statistical Software”, versão 2.2.7 para Windows 98. As diferenças entre os grupos tratados e controles positivos de insetos foram consideradas sem significância estatística quando p > 0,05.

3.4.2 Atividade Acaricida

Os ensaios para avaliação de atividade acaricida foram realizados em colaboração com a professora Drª. Evelize Folly das Chagas, Instituto de Biologia, Laboratório de Metabolismo de Parasitos, Departamento de Biologia Celular e Molecular (GCM/UFF). O ácaro utilizado foi o carrapato Rhipicephalus microplus.

Os carrapatos são oriundos da colônia mantida na Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Brasil, criados seguindo a metodologia de Parizi et al.,(2009). Cepas de R. microplus (Acari: Ixodidae) foram obtidas de bezerros criados em uma área livre de carrapatos. Fêmeas adultas ingurgitadas foram mantidas em placas de Petri a 28 °C e 80 % de humidade relativa, após a conclusão da oviposição, que começa aproximadamente três dias depois que os carrapatos adultos caem dos bezerros. Os animais foram tratados de acordo com a Comissão de Revisão para Cuidados Animais (UFRGS).

Para verificação da eficácia carrapaticida in vitro do óleo essencial de Zanthoxylum tingoassuiba, foram preparadas três concentrações de 5,0%, 2,5% e 1,25% de óleo essencial solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO).

Para o Teste de Imersão de Adultos (AIT), foi seguida a metodologia Drummond e colaboradores (1973), adaptada pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Metabolismo de Parasitos, GCM/UFF. Fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram pesadas (peso médio 0,3 g), separadas em grupos de 15 com pesos homogêneos, em triplicata, para cada concentração, incluindo o grupo controle. Os grupos foram imersos em 5,0 mL das soluções testes, agitados vagarosamente por 1 minuto. O excesso da solução foi removido com papel absorvente, os carrapatos foram então colocados em placa de Petri, e acondicionados em estufa BOD (Biochemical Oxygen Demand) a 28ºC e 70% de umidade relativa. Após 24h iniciaram-se as observações para verificação da ocorrência ou não de mortalidade e postura. As observações foram mantidas até o 14º dia após a incubação. Os ovos foram pesados e observados por mais 14 dias para verificação da eclosão e formação de larvas.

Para o teste de avaliação da eclodibilidade 0,3 g de ovos foram pesados e colocados em tubos de vidro fechados com tampão de algodão. Foram utilizadas as mesmas concentrações de óleo essencial usadas no teste de imersão de adultos, ou seja, 5,0 %, 2,5 %, 1,25 % e DMSO 1,0% como controle. As soluções foram injetadas para dentro do tubo com auxílio de uma seringa. Após 2 minutos, os tubos foram invertidos e o excesso de óleo absorvido pelo tampão de algodão. Os tratamentos foram realizados em triplicata, mantidos a 27°C e 75% de umidade (BOD), por um período de 14 dias.

3.4.2.1 Análise Estatística dos Dados

A significância dos resultados foi expressa como a média ± erro padrão da média. Os grupos foram comparados utilizando-se ANOVA. Com valor de p < 0,05 foi considerado com significância. A análise estatística foi realizada utilizando software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Softhware Inc., San Diego, EUA). A avaliação do Índice de Postura (IP) e % Inibição de Postura foram avaliadas após 14 dias de tratamento, segundo a metodologia de Ribeiro et al.,(2008).

Índice de Postura (IP) = _peso de ovos eclodidos (g) peso inicial de fêmeas (g)

% Inibição Postura = postura (IP grupo controle – IP grupo tratado) x 100 IP grupo controle