Após as análises em larga escala dos dados obtidos do RNAseq, foram selecionados
13 genes relacionados as respostas de defesa da planta, que eram compartilhados entre
cultivares ou exclusivos de alguma cultivar para avaliação da expressão gênica por RT-qPCR
(Figura 25 e 26). Dessa forma, Aspartic proteinase oryzasin-1 (APO) e Pathogenesis-related
protein 1C (PRMS – 1; PRMS – 2) são comuns entre os três genótipos; Cellulose synthase A
catalytic subunit 7 (CESA7)
é comum para ‘Maçã’ e ‘Prata-anã’; Putative Probable
glutathione S-transferase (GSTU6) e Putative Pathogenesis-related protein PRB1-3 (PRB1-3)
são comuns para ‘Maçã’ e ‘BRS Platina’; 14 kDa proline-rich protein DC2.15 (TPRP-F1) é
comum para ‘Prata-anã’ e ‘BRS Platina’; Peroxidase 64 (PER64) e Superfamily of TFs having
WRKY and zinc finger domains (WRKY50) são exclusivos para ‘Maçã’; Aquaporin PIP2-3
(PIP2-3) e Ubiquitin-conjugating enzyme E2-17 kDa (UBC10) são exclusivas para ‘Prata-
anã’; Putative Disease resistance response protein 206 (PI206) (NB-LRR) e Auxin
Os valores de expressão obtidos pelo RT-qPCR foram normalizados pelo gene de
referência Actina 2 e, as análises foram realizadas das amostras inoculadas com o fungo em
cada tempo em relação ao tempo 0 h sem inoculação. Não foi possível fazer correlação dos
valores de expressão (log
2fold change) obtidos por RNAseq com os dados de RT-qPCR, pois
as bibliotecas foram sequenciadas em pool contendo amostras coletadas a 12, 24, 36 e 48 HAI
e a análise de expressão gênica por RT-qPCR foi realizada em oito tempos após inoculação
(0, 12, 24, 36, 48, 72, 120 e 192 HAI).
O gene CESA7 (Figura 25A) relaciona-se a biogênese de parede celular e foi induzido
em todos os períodos de análise em ‘BRS Platina’, exceto em 120 HAI, com maior valor de
expressão após 12, 48 e 192 HAI em ‘BRS Platina’. Em ‘Prata-anã’ o gene CESA7 foi
reprimido na maioria dos tempos analisados, com leve indução após 24, 120 e 192 HAI. Já em
‘Maçã’ esse gene foi reprimido em todos os tempos analisados. Esse resultado sugere que a
cultivar resistente apresenta um nível de expressão basal (0 HAI) desse gene, com maior
indução após 12 HAI relacionando-se com o reforço da parede celular a fim de limitar a
colonização do fungo.
Genes relacionados ao estresse oxidativo como, peroxidase (PER64) (Figura 25B) e
glutationa-S-transferase (GSTU6) (Figura 25C) foram induzidos nas cultivares ‘BRS Platina’
e ‘Prata-ana’ na maioria dos tempos analisados; e reprimidos na maioria dos períodos
analisados em ‘Maçã’, com leve indução em 36 e 120 HAI para o gene PER64. O gene
GSTU6 em ‘BRS Platina’apresenta alta indução até 72 HAI quando comparado com ‘Prata-
anã’, com um pico siginificativo de expressão em 48 HAI.
Por outro lado, o gene TPRP-F1 (Figura 25D) foi induzido em todos os períodos
analisados em ‘Prata-anã’ e reprimidos em todos os tempos de análise em ‘BRS Platina’. Em
‘Maçã’ houve uma leve indução em 120 e 192 HAI. Esse gene codifica para uma proteína
(DC2.15) rica no aminoácido prolina, que por sua vez, sugere uma relação aos estresses
biótico e abiótico. Aspartic proteinase oryzasin-1 (APO) (Figura 25E) foi induzido a partir de
12 HAI em ‘BRS Platina’ e reprimido em ‘Maçã’ em todos os tempos analisados . Em ‘Prata-
anã’ só houve uma leve indução desse gene em 36 HAI.
Aquaporin PIP2-3 (PIP2-3) (Figura 25F) relaciona-se ao transporte de água mediado
por uma proteína canal transmembrana. Esse gene foi levemente induzido em ‘BRS Platina’
na maioria dos tempos analisados, exceto em 36 HAI. Em ‘Prata-anã’ houve leve indução em
0, 12, 36, 48, 120 e 192 HAI e, em ‘Maçã’ esse gene foi reprimido em todos os períodos
analisados. Foc é um fungo que coloniza o xilema e impede a livre passagem de água na
planta, o que sugere estar ocorrendo em‘Maçã’, que é suscetível. Esse fungo causa murcha,
decorrente do acúmulo de micélio no xilema e também das respostas de defesa da planta,
como produção de tilose, gomas e calose. Sendo assim, o nível de expressão nula em ‘BRS
Platina’ em 120 e 192 HAI pode ser decorrente da indução de respostas de defesa. Ubiquitin-
conjugating enzyme E2-17 kDa (UBC10) (Figura 25G) foi levemente induzido em ‘BRS
Platina’ nos períodos analisados, exceto em 36 e 120 HAI. Em ‘Prata-anã’ esse gene só foi
levemente induzido em 120 HAI e em ‘Maçã’ o gene UBC10 foi reprimido em todos os
períodos analisados.
Os genes relacionados a patogênese, como PRMS – 1 (Figura 26A) e PRMS – 2
(Figura 26B) foi induzido na maioria dos períodos analisados em ‘BRS Platina’ com um pico
significativo de indução em 48 e 72 HAI. Em ‘Prata-anã’ houve uma leve indução dos genes
PRMS – 1 e PRMS – 2 em 12, 36, 48 e 120 HAI, e em ‘Maçã’ houve uma leve indução desses
genes em 48 HAI. Essses resultados sugerem que na cultivar ‘BRS Platina’ há indução desses
genes desde 0 HAI até 72 HAI demonstrando que esta cultivar responde a interação com o
Foc, aumentando o nível de expressão gênica.
PRB1-3 (Figura 26C) foi induzido em todos os períodos nas três cultivares, com um
pico de indução em 48 e 72 HAI em ‘BRS Platina. O gene PI206 (NB-LRR) (Figura 26D),
apresentou um pico de expressão em 48 HAI em ‘BRS Platina’, mas houve indução em todos
os períodos analisados para ‘BRS Platina’ e ‘Prata-anã’. Em ‘Maçã’ houve uma leve indução
a partir de 48 HAI.
A expressão do gene WRKY50 (Figura 26E) foi praticamente nula nas três cultivares
até 36 HAI. Em ‘BRS Platina’ houve indução desse gene em 48, 72 e 192 HAI. Em ‘Prata-
anã’ só houve indução em 120 HAI, e em ‘Maçã’ houve indução em 48 e 72 HAI. Esse gene
atua na indução de expressão de genes de defesa ao estresse biótico. O gene ATL (Figura 26F)
foi induzido nas três cultivares em alguns períodos analisados. Em ‘BRS Platina’ o gene ATL
foi levemente induzido em 24, 48, 72 e 192 HAI; em ‘Prata-anã’ esse gene foi levemente
induzido em 24 e 120 HAI; e em ‘Maçã’ houve indução em 48 e 72 HAI.
Os genes compartilhados (APO, PRMS – 1, PRMS – 2, CESA7, GSTU6 e PRB1-3)
e/ou exclusivos (PER64 e WRKY50) para a cultivar ‘Maçã’ pelo RNAseq apresentaram um
perfil similar na análise de expressão pelo RT-qPCR no tempo de 48 HAI,em que os genes
PRMS – 1 (Figura 26A), PRMS – 2 (Figura 26B), GSTU6 (Figura 25C), PRB1-3 (Figura
26C)e WRKY50 (Figura 26E) demonstraram ser induzidos por meio das duas técnicas. Já o
gene APO (Figura 25E) foi down regulated na análise do transcriptoma pelo RNAseq e pelo
RT-qPCR. Os genes CESA7 (Figura 25A) e PER64 (Figura 25B) demonstraram ser induzidos
na análise por RNAseq e reprimidos pelo RT-qPCR.
Para a cultivar ‘Prata-anã’, o perfil de expressão (indução) dos genes PRMS – 1
(Figura 26A), PRMS – 2 (Figura 26B), APO (Figura 25E)e PIP2-3 (Figura 25F) foi idêntico
entre o RNAseq e o RT-qPCR para as amostras coletadas a 36 HAI. O gene TPRP-F1 (Figura
25D) foi induzido em todos os períodos de análise pelo RT-qPCR e reprimido pelo RNAseq.
A maioria dos genes estão up regulated em todos os momentos de análise para a
cultivar ‘BRS Platina’ pelo RT-qPCR, com exceção do gene TPRP-F1. Os genes PRMS – 1,
PRMS – 2, GSTU6, PRB1-3, TPRP-F1, PI206 e ATL estão up regulated por meio do
RNAseq, com exceção do gene APO que está reprimido. De forma geral, no período de 24 e
48 HAI o padrão de expressão gênica foi similar para o RNAseq e o RT-qPCR para os genes
PRMS – 1 (Figura 26A), PRMS – 2 (Figura 26B), PRB1-3 (Figura 26C), GSTU6 (Figura
25C), PI206 (Figura 26D) e ATL (Figura 26F), nos quais foram induzidos em ambas as
técnicas. A análise dos dados de expressão gênica por meio do RNAseq (pool de amostras
coletadas a 12, 24, 36 e 48 HAI) e RT-qPCR (amostras coletadas a 0, 12, 24, 36, 48, 72, 120 e
192 HAI) demonstram a indução da expressão dos genes relacionados a sinalização, defesa e
resistência da cultivar resistente em relação as outras cultivares.
Figura 25 - Perfil de expressão relativa dos genes Cellulose synthase A catalytic subunit 7 (CESA7)
(A); Peroxidase 64 (PER64) (B); Putative Probable glutathione S-transferase (GSTU6)
(C); 14 kDa proline-rich protein DC2.15 (TPRP-F1) (D); Aspartic proteinase oryzasin-1
(APO) (E); Aquaporin PIP2-3 (PIP2-3) (F); Ubiquitin-conjugating enzyme E2-17 kDa
(UBC10) (G) em amostras inoculadas com o Fusarium oxysporum f. sp. cubense em
relação ao controle não inoculado no tempo 0 h. As quantificações foram normalizadas
utilizando o gene de referência Actina 2
Figura 26 - Perfil de expressão relativa dos genes Pathogenesis-related protein 1C (PRMS – 1) (A);
Pathogenesis-related protein 1C (PRMS – 2) (B); Putative Pathogenesis-related protein
PRB1-3 (PRB1-3) (C); Putative Disease resistance response protein 206 (PI206) (D);
Superfamily of TFs having WRKY and zinc finger domains (WRKY50) (E); Auxin
transporter-like protein 1 (ATL) (F) em amostras inoculadas com o Fusarium oxysporum f.
sp. cubense em relação ao controle não inoculado no tempo 0 h. As quantificações foram
normalizadas utilizando o gene de referencia Actina 2
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Estudos histológicos e moleculares da interação Musa spp. x Fusarium oxysporum f....
(páginas 72-78)