Para analisar a fase de expansão das CTM-CU no Biorreator WaveTM eliminando a variável relacionada à fase de adesão célula-microcarregador, foram realizados quatro cultivos com fase de adesão em frasco spinner de 0,5 L, operando com 0,2 L, com microcarregador CultiSpher-S® na concentração de 2,1 gMC/L, e posterior transferência para a Cellbag após 24 h de cultura, operando com 0,7 gMC/L. No cultivo SWmod4CS foi avaliada a utilização do suplemento Pluronic F-68 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA), a fim de promover proteção celular.
Cultivo SWmod1CS
A Figura 32 apresenta o comportamento do cultivo da CTM-CU durante o SWmod1CS. O SWmod1CS apresentou 86,3% de adesão das células aos microcarregadores, segundo o dado de células aderidas obtido pelo método MTT.
Neste cultivofoi realizado estudo para averiguar a melhor condição de agitação da plataforma, com o formato da Cellbag modificado. Aplicando 30 rpm e 4° mantidos por 2 h, em cultivo com 48 h de operação, verificou-se aumento do número de microcarregadores sendo depositados no plástico sem retornar para o líquido. Com 27 rpm e 4° verificou-se pequena adesão de microcarregadores nas bordas da Cellbag, entre 48 e 72 h. Mantida essa agitação, ocorreu adesão considerável dos microcarregadores na região de borda líquido-gás entre 72 e 96 h, o que pode ter provocado estagnação do crescimento. Assim, definiu-se 24 rpm como agitação máxima de trabalho para 4° de inclinação da plataforma. A agitação foi mantida em 24rpm/4° entre 96 e 168 h, passando para 27rpm/3°, entre 168 e 240 h, para amenizar o depósito de microcarregadores na região de borda líquido-gás.
Conforme analisado na Figura 32, não houve esgotamento dos principais nutrientes e as concentrações máximas de lactato e amônia foram de 5,63 m M e 1,76 mM com 240 h de operação, respectivamente, valores não inibitórios para o cultivo da CTM-CU (SCHOP et al., 2009). A relação Yl ac/glc foi de 1,54±0,65 (mollac/molglc) na fase de crescimento. O consumo específico médio de glicose foi de 0,34±0,14 (pmolglc.cel-1.h-1) e a produção específica média de lactato foi de 0,42±0,18 (pmollac.cel-1.h-1).
5. RESULTADOS
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Figura 32. Cultivo SWmod1CS: Cultivo da CTM-CU em meio de cultivo α-MEM sem fenol suplementado com glicose, glutamina, arginina, antibiótico (1% v/v) e SFB (10% v/v). Fase de adesão em frasco spinner e transferência para o Biorreator WaveTM com 24 h. Concentração de CultiSpher-S® de 2,1 e 0,7 gMC/L nas fases de adesão e expansão, respectivamente, com relação célula/MC de 30. Volume de trabalho de 200 mL na fase de adesão e de 600 mL no início da operação no Biorreator WaveTM. Condições de operação do Biorreator WaveTM; dados de pH; níveis de glicose, glutamina, arginina, lactato e amônia presentes no meio de cultivo; número de CTM- CU aderidas aos microcarregadores.
5. RESULTADOS
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O fator de expansão alcançado considerando as células aderidas foi de 7,0 vezes, com 216 h, e 6,0 vezes, considerando o total de células inoculadas. A velocidade específica de crescimento foi de 0,017 h-1 (R2 = 0,998), entre 96 e 168 h. A produtividade do cultivo foi de 1,5 x 107 cel.L-1.d-1. O LDH máximo liberado no meio de cultivo (normalizado com relação ao LDH inicial) foi de 1,22±0,01, com 240 h, valor semelhante ao obtido no cultivo em frasco spinner com microcarregador CultiSpher- S®.
Foi observado, com 192 h, depósito nível 3 de microcarregadores na região de borda líquido-gás, conforme apresentado na Figura 33. O diâmetro médio máximo de agregados foi de 0,253±0,093 mm com 240 h (Figura 34). Os maiores diâmetros de partículas observados foram de 0,629 mm (72 h) e 0,616 mm (216 h). Jossen e colaboradores (2016) relataram agregados com diâmetro de 6 mm na expansão de CTM proveniente de tecido adiposo em biorreator com movimento ondulatório (JOSSEN et al., 2016). Em 240 h, o cultivo apresentou queda no crescimento, possivelmente relacionado à falta de espaço nos agregados de microcarregadores e ao baixo número de células em alguns microcarregadores, os quais podem ter sido originados nos eventos de deposição dos microcarregadores no plástico da Cellbag. Os microcarregadores aderidos ao plástico retornavam ao líquido durante os procedimentos diários de retirada de amostra.
Figura 33. Cultivo SWmod1CS: Setas indicam depósito nível 3 de microcarregadores na superfície lateral da Cellbag, região de borda líquido-gás, observado com 192 h de operação. Localização do depósito indicada pelo retângulo pontilhado presente na vista superior da Cellbag.
5. RESULTADOS
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Figura 34. Cultivo SWmod1CS: (A) Distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores (□) e (B) diâmetro médio de partículas de microcarregadores (■) obtidos durante o cultivo da CTM-CU.
Cultivo SWmod2CS
O cultivo SWmod2CS apresentou 90% de adesão das células aos microcarregadores, segundo o dado de células aderidas obtido pelo método MTT (Figura 35). Durante o período de adesão o pH saiu da faixa ótima, atingindo 7,60 com 3,5 h. Entre 48 - 72 h e 216 - 240 h, foi observada pequena formação de depósito de microcarregadores aderidos ao plástico, na região de borda líquido-gás, considerado nível 1. Esse fato, juntamente com a elevação de pH e a necessidade de adaptação das células à hidrodinâmica do Biorreator WaveTM, podem ter acarretado no maior tempo para atingir a fase de crescimento, a qual iniciou com 144 h, verificado na Figura 35.
Não ocorreu esgotamento dos principais nutrientes e as concentrações máximas de lactato e amônia foram de 4,61 mM e 1,64 mM com 240 h de operação, respectivamente, níveis não inibitórios para o cultivo da CTM-CU (SCHOP et al., 2009). A relação de consumo de glicose e produção de lactato, Ylac/glc, apresentou valor de 1,72±0,84 (mollac/molglc) para a fase de crescimento. O consumo específico médio de glicose foi de 0.20±0,13 (pmolglc.cel-1.h-1) e a produção específica média de lactato foi de 0.29±0,09 (pmollac.cel-1.h-1).
5. RESULTADOS
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Figura 35. Cultivo SWmod2CS: Cultivo da CTM-CU em meio de cultivo α-MEM sem fenol suplementado com glicose, glutamina, arginina, antibiótico (1% v/v) e SFB (10% v/v). Fase de adesão em frasco spinner e transferência para o Biorreator WaveTM com 24 h. Concentração de CultiSpher-S® de 2,1 e 0,7 gMC/L nas fases de adesão e expansão, respectivamente, com relação célula/MC de 30. Volume de trabalho de 200 mL na fase de adesão e de 600 mL no início da operação no Biorreator WaveTM. Condições de operação do Biorreator WaveTM; dados de pH; níveis de glicose, glutamina, arginina, lactato e amônia presentes no meio de cultivo; número de CTM- CU aderidas aos microcarregadores.
5. RESULTADOS
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O fator de expansão celular atingiu 7,7 vezes considerando as células aderidas aos microcarregadores com 24 h e 7,0 vezes considerando o número de células inoculadas. A velocidade específica de crescimento foi de 0,035 h-1 (R2 = 0,997), entre 144 e 192 h . A produtividade do cultivo foi de 1,7 x 107 cel.L-1.d-1. O LDH máximo liberado no meio de cultivo (normalizado com relação ao LDH inicial) foi de 1,45±0,01, com 240 h.
A Figura 36 mostra a distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores e a variação do diâmetro médio de partículas ao longo do cultivo SWmod2CS. O maior diâmetro de agregado observado foi de 0,544 mm, com 192 h, e o diâmetro médio máximo observado foi de 0,249±0,090 mm, com 216 h. Com 240 h, término do cultivo, ocorreu retenção de microcarregadores no plástico (nível 1) e verificou-se a presença de agrupamentos de microcarregadores no líquido. Contudo, esses agrupamentos não estavam ligados de forma coesa, já que não se verificou elevados valores médios de diâmetro de partículas.
Figura 36. Cultivo SWmod2CS: (A) Distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores (□) e (B) diâmetro médio de partículas de microcarregadores (■) obtidos durante o cultivo da CTM-CU.
5. RESULTADOS
79 Cultivo SWmod3CS
O cultivo SWmod3CS apresentou 100% de adesão das células inoculadas aos microcarregadores, segundo o dado de células aderidas obtido pelo método MTT (Figura 37). O pH manteve-se na faixa ideal, entre 6,8 - 7,4 e não houve esgotamento dos principais nutrientes. As concentrações máximas de lactato e amônia foram de 5,34 mM e 1,76 mM, com 240 h de operação, respectivamente. Tais níveis não são inibitórios para o crescimento da CTM-CU (SCHOP et al., 2009).
Figura 37. Cultivo SWmod3CS: Cultivo da CTM-CU em meio de cultivo α-MEM sem fenol suplementado com glicose, glutamina, arginina, antibiótico (1% v/v) e SFB (10% v/v). Fase de adesão em frasco spinner e transferência para o Biorreator WaveTM com 24 h. Concentração de CultiSpher-S® de 2,1 e 0,7 gMC/L nas fases de adesão e expansão, respectivamente, com relação célula/MC de 30. Volume de trabalho de 200 mL na fase de adesão e de 600 mL no início da operação no Biorreator WaveTM. Condições de operação do Biorreator WaveTM; dados de pH; níveis de glicose, glutamina, arginina, lactato e amônia presentes no meio de cultivo; número de CTM- CU aderidas aos microcarregadores.
5. RESULTADOS
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A relação entre o consumo de glicose e produção de lactato, Ylac/glc, apresentou valor de 1,33±0,17 (mollac/molglc) para a fase de crescimento. A relação de Ylac/glc menor que o valor de referência, Ylac/glc de 2,0 (mollac/molglc), indica metabolismo eficiente de consumo de glicose, utilizando a rota de fosforilação oxidativa (SCHOP, 2010). O consumo específico médio de glicose foi de 0,21±0,08 (pmolglc.cel-1.h-1) e a produção específica média de lactato foi de 0,28±0,08 (pmollac.cel-1.h-1).
O fator de expansão celular atingiu 5,8 vezes com 216 h. A velocidade específica de crescimento foi de 0,015 h-1 (R2 = 0,996), entre 120 e 192 h. A produtividade do cultivo foi de 1,4 x 107 cel.L-1.d-1. O LDH máximo liberado no meio de cultivo (normalizado com relação ao LDH inicial) foi de 1,24±0,01, com 216 h.
Assim como no cultivo SWmod2CS, com 240 h verificou-se a presença de agrupamentos de microcarregadores no líquido (Figura 38). A Figura 39 apresenta a distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores e o diâmetro médio de partículas ao longo do cultivo SWmod3CS. O diâmetro médio máximo observado foi de 0,242±0,084 mm, com 168 h, obtendo-se leitura de partícula com diâmetro de 0,662 mm nesse ponto e de 0,638 mm com 72 h. Com 120 h, foi observado faixas de depósitos de microcarregadores (nível 2), não sendo mais verificado depósito no restante do cultivo. Apesar de apresentar agregados de microcarregadores com diâmetro na ordem de 0,600 mm, as médias dos diâmetros de partículas obtidas não foram problemáticas, já que permaneceram abaixo de 0,300 mm (diâmetro de partícula limite no qual não ocorre restrição na transferência de massa) (KINNEY; SARGENT; MCDEVITT, 2011; SEN; KALLOS; BEHIE, 2001).
Figura 38. Cultivo SWmod3CS: Imagem do fundo da Cellbag com 240 h de operação (término do cultivo). Setas indicam agrupamentos de microcarregadores.
5. RESULTADOS
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Figura 39. Cultivo SWmod3CS: (A) Distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores (□) e (B) diâmetro médio de partículas de microcarregadores (■) obtidos durante o cultivo da CTM-CU.
Cultivo SWmod4CS
Assim como no SWmod3CS, o cultivo SWmod4CS apresentou 100% de adesão das células inoculadas aos microcarregadores, segundo o dado de células aderidas obtido pelo método MTT. Após 24 h de operação (período operado no frasco spinner), foi adicionado Pluronic-F68 (Gibco - Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) ao meio de cultivo, na concentração final de 0,1%. Tal como observado no gráfico do número de CTM-CU aderidas aos microcarregadores (Figura 40), a adição de Pluronic-F68 não retardou o começo da fase de crescimento exponencial, comparando com os demais cultivos, a qual teve início com 72 h.
Conforme analisado na Figura 40, não houve esgotamento dos principais nutrientes e as concentrações máximas de lactato e amônia foram de 6,0 mM e 1,83 mM com 240 h de operação, respectivamente. Esses valores não são inibitórios para o cultivo da CTM-CU (SCHOP et al., 2009). A relação, Ylac/glc, foi de 1,43±0,32 (mollac/molglc) na fase de crescimento, indicando metabolismo eficiente de consumo de glicose. O consumo específico médio de glicose foi de 0,21±0,06 (pmolglc.cel-1.h-1) e a produção específica média de lactato foi de 0,30±0,11 (pmollac.cel-1.h-1).
No SWmod4CS foi obtido o maior fator de expansão celular entre os cultivos Spinner-Wavemod, o qual foi de 8,5 vezes com 216 h. A velocidade específica de crescimento foi de 0,013 h-1 (R2 = 0,999), entre 72 h e 192 h. A produtividade celular do cultivo foi de 2,6 x 107 cel.L-1.d- 1. Apesar da adição de Pluronic-F68, o LDH máximo
5. RESULTADOS
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liberado no meio de cultivo (normalizado com relação ao LDH inicial) foi de 1,35±0,02 com 240 h, o segundo maior nível de LDH registrado entre os cultivos Spinner- Wavemod.
Figura 40. Cultivo SWmod4CS: Cultivo da CTM-CU em meio de cultivo α-MEM sem fenol suplementado com glicose, glutamina, arginina, antibiótico (1% v/v) e SFB (10% v/v). Fase de adesão em frasco spinner e transferência para o Biorreator WaveTM com 24 h. Concentração de CultiSpher-S® de 2,1 e 0,7 gMC/L nas fases de adesão e expansão, respectivamente, com relação célula/MC de 30. Volume de trabalho de 200 mL na fase de adesão e de 600 mL no início da operação no Biorreator WaveTM. Após 24 h (período operado no frasco spinner), adição de Pluronic-F68 ao meio de cultivo na concentração final de 0,1%. Condições de operação do Biorreator WaveTM; dados de pH; níveis de glicose, glutamina, arginina, lactato e amônia presentes no meio de cultivo; número de CTM-CU aderidas aos microcarregadores.
5. RESULTADOS
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Com 192 h foi observada pequena faixa de microcarregadores na região de borda líquido-gás (nível 1), sendo essa deposição maior a partir de 216 h, com depósito de microcarregadores nível 3, conforme verificado na Figura 41. A Figura 42 apresenta a distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores e o diâmetro médio de partículas ao longo do cultivo SWmod4CS. O diâmetro médio máximo observado foi de 0,240±0,078 mm com 192 h, apresentando diâmetro de partícula máximo de 0,592 mm nesse ponto.
Figura 41. Cultivo SWmod4CS: Setas indicam depósito nível 3 de microcarregadores na superfície lateral da Cellbag, região de borda líquido-gás, observado com 216 h de operação. Localização do depósito indicada pelo retângulo pontilhado presente na vista superior da Cellbag.
Figura 42. Cultivo SWmod4CS: (A) Distribuição do diâmetro de partículas de microcarregadores (□) e (B) diâmetro médio de partículas de microcarregadores (■) obtidos durante o cultivo da CTM-CU.
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