Análise fitoquímica

Uma alíquota do extrato foi dissolvida em diferentes solventes (8:2v/v, Hexano/Diclorometano, Hexano/Metanol, Hexano/Acetato de Etila) e procedeu-se a cromatografia em camada delgada (CCD), que demonstrou a presença de diferentes compostos químicos no HPC, com melhor separação dos compostos para a mistura Hexano/Diclorometano Fig. 23. O fracionamento, através de cromatografia em coluna de gel de sílica, da fase (Hexano/Diclorometano) da partição do extrato hexânico da alga Prasiola

crispa resultou no isolamento e identificação como sendo, fitoesteróis (esteróis de plantas),

através das informações fornecidas por seus espectros de RMN o; Campesterol (24α-metil- colest-5-enol) peso molecular (400.68), Stigmasterol (24α-etil-colest- 5,22-dienol) peso molecular (412.69) e β-sitosterol (24α-etil-colest-5-enol) peso molecular (414.71) (Fig. 24), descoberta inéditas na espécie. A identificação individual de cada substância foi realizada levando-se em conta o padrão de hidrogênação de cada átomo de carbono, os deslocamentos químicos dos átomos de carbono, principalmente dos carbonos de ligação dupla, e ainda o número de metilas e multiplicidade destas, observadas nos espectros de RMN1H.

A B C D

Figura 24 - Cromatografia de camada delgada (CCD) do extrato bruto (EB) de Prasiola crispa. Os eluentes

tilizados foram (A) hexano; (B) diclorometano; (C) acetato de etila; (D) metanol, em gradiente crescente de polaridade, resultando em quatro frações.

EB P. crispa HEXANO Hexano/ Diclorometano 8:2 EB P. crispa DICLOROMETA NO Hexano/ Acetona 8:2 EB P. crispa ACETATO DE ETILA Hexano/ Acetona 8:2 EB P. crispa METANOL Hexano/ Acetona 8:2

Figura 25 - Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) da fração hexânica com a identificação dos

compostos β-Sitosterol, Stigmasterol e Campesterol. Campesterol

5. DISCUSSÃO

Nesse trabalho foi demostrada a atividade neurobiológica do extrato bruto de Prasiola

crispa. Também procedeu-se a identificação por RMN de três compostos envolvidos na

atividade neurotóxica do extrato em baratas da espécie Nauphoeta cinerea. Serão discutidos abaixo os aspectos relacionados aos mecanismos envolvidos na atividade biológica de

Prasiola crispa sobre os diferentes sistemas neurofisiológicos de baratas da espécie Nauphoeta cinerea.

Os ensaios para a determinação da atividade entomotóxica do extrato bruto de

Prasiola crispa demonstraram que esse composto possui atividade letal para as baratas,

reforçando o seu potencial como inseticida natural. De fato nossos dados corroboram os de ZEMOLIN et al., (2012), que demostrou que o extrato metanólico de Prasiola crispa também é letal para a mosca das frutas Drosophila melanogaster.

Nesse sentido foi demonstrado no extrato hexânico a presença de fitoesteróis relacionados à atividade tóxica da Prasiola crispa. De fato, a literatura demonstra a relação entre a atividade inseticida de extratos vegetais e a presença de fitoesteróis (ZOLOTAR, et

al., 2002). TABATA et al (2008) demonstraram que em cultura de células de camundongos a

incubação do β-sistosterol induziu neurotoxicidade sobre os neurônios. MIKOLAJCZAK et

al., (1987), demonstrarm que os extratos de Trichilia pallida, T. connoroides, T. prieureana, T. roka e T. triphyllaria induziram mortalidade igual ou superior a 80% em S. frugiperda. A

investigação fitoquímica desses extratos levou à identificação de compostos como as cumarinas, escoporona, escopoletina, umbeliferona, o limonóide 11-β-acetoxiobacunona, e a mistura dos esteróides stigmasterol, β-sitosterol e campesterol.

Além disso, os ensaios para a medida da atividade da enzima colinesterase de homogeinizado de cérebro de Nauphoeta cinerea, demonstraram que o HPC não inibe

significativamente essa enzima. Esse dado reforça o fato de que o efeito entomotóxico do HPC não deve estar associado a essa atividade, como foi também previamente demonstrado por ZEMOLIN et al., (2012). Dessa forma é improvável que pelo menos em parte a atividade entomotóxica do extrato esteja associada a uma atividade inibidora da colinesterase.

Em nossas condições experimentais quando o HPC foi ensaiado sobre o sistema cardiovascular de Nauphoeta cinerea, demonstrou-se uma alteração significativa da frequência cardíaca. A adição de anticolinesterásicos na preparação do coração semi-isolado de baratas induz um aumento ou decréscimo da freqüência cardíaca, dependendo da concentração ensaiada (POLSINELLI et al., 2010). Considerando-se que em nosso estudo o HPC não teve qualquer efeito sobre a atividade da acetilcolinesterase, este mecanismo parece não estar envolvido no efeito cardiotóxico observado. Dessa forma os nossos dados sugerem que o HPC está atuando como um despolarizante dos nervos adjacentes ao coração, o que poderia aumentar a liberação do neurotransmissor acetilcolina ou octopamina, induzindo auterações da freqüência cardíaca. Tal hipótese parece comprovar-se pela demonstração na literatura de compostos vegetais, como o de Parthenium hysterophorus, que induz efeitos despolarizantes em modelos de insetos (KUSHWAHA e MAURYA, 2012).

Os ensaios com o HPC em preparações neuromusculares de N. cinerea demonstraram um efeito bloqueador neuromuscular progressivo que levou a cessação completa das respostas contráteis. Além disso, foram observadas contrações espontâneas que indicam uma despolarização persistente da placa motora desses insetos (DOUGLAS e PATON, 1954). De fato, o efeito induzido pelo HPC sobre a neurotransmissão periférica de Nauphoeta cinerea assemelha-se ao dos piretróides. Em relação a esses últimos, desenvolvem a sua atividade entomotóxica por ativarem persistentemente canais iônicos de sódio na musculatura dos insetos, fazendo com que haja uma despolarização persistente da membrana muscular, aumentando o número de potenciais de ação, causando a morte dos animais por paralisia

motora (DAVIES et al., 2007). Apesar de em nossas condições experimentais o DNQX, um inibidor seletivo dos receptores Ampa e Kainato (NAKANISHI, 1992), não ter previnido o bloqueio neuromuscular induzido pelo HPC, o mesmo foi obtido pelo tratamento prévio das preparações com hidrato de cloral. Em insetos a neurotransmissão periférica é modulada tanto pelo neurotransmissor GLU (glutamato), excitatório, quanto pelo GABA (ácido-gama- aminobutírico), que é inibitório (MAYER e WESTBROOK, 1987). Esses dois neurotransmissores parecem complementar-se no sentido de orquestrarem os fenômenos de contração e relaxamento da musculatura esquelética das pernas dos insetos, organizando a locomoção (HUBER, 1990). Em invertebrados os receptores de glutamato são do tipo AMPA que, quando ativados, induzem um rápido influxo de Na+ e Ca+ e um posterior efluxo de K+ (BHATT e COOPER, 2005). Os receptores ionotrópicos de glutamato que são canais iônicos integrais do tipo ligante-ativados são subdivididos em três subtipos, baseados na sua sensibilidade: Kainato (KA) (Ácido 2-carboxi-4-(1-metiletenil)-3-pirrolidinacético), AMPA

(alfa amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propionato) e NMDA (N-metil-D-aspartato). Os receptores AMPA e os KA medeiam a neurotransmissão excitatória rápida, enquanto os receptores NMDA evocam correntes com cinéticas de ativação mais lentas (WASHIO, 2002). Nesse sentido os receptores NMDA localizam-se na membrana pós-sináptica das sinapses excitatórias e exibem maior permeabilidade ao Ca2+ do que os receptores AMPA e KA, característica que lhe confere um papel mais ativo em mecanismos neurotóxicos. Por sua vez, os receptores de glutamato metabotrópicos são acoplados a proteína G e participam dos mecanismos de resposta intracelular através da ativação de segundos mensageiros. Por esse motivo, são responsáveis pela geração de respostas pós-sinápticas mais lentas (KUBO, 2004). De fato a prevenção parcial do bloqueio neuromuscular pelo prévio tratamento das preparações com o hidrato de cloral, sugere que os compostos bioativos do extrato esteja ativando receptores ionotrópicos do tipo NMDA e AMPA (KORNHUBER e WELLER,

1997) Além disso, o prévio tratamento dos animais com bicuculina, um inibidor seletivo dos receptores GABA ionotrópicos, também previniu o bloqueio neuromuscular induzido pelo HPC. Esse último resultado sugere que a despolarização da placa motora dos insetos pelo HPC estaria em última análise aumentando a liberação do neurotransmissor GABA, produzindo um aumento do recrutamento da musculatura inibitória (HUBER et al., 1990). Varios compostos inseticidas vegetais possuem atividade permeabilizante de membranas biológicas (STANIÇUASKI e CARLINI, 2012). Nesse sentido, a neurotransmissão ganglionar em baratas envolve a liberação do neurotransmissor octopamina (HUBER et al., 1990). O tratamento prévio das preparações neuromusculares com fentolamina retardou o desenvolvimento do bloqueio neuromuscular em Nauphoeta cinerea. Esses dados sugerem que os compostos bioativos do extrato estejam despolarizando a região do terceiro gânglio metatorácico, na qual já foi descrita a presença de receptores AMPA e NMDA (I. HUBER et

al., 1990).

Em nossas condições experimentais, o ensaio do HPC in vivo também induziu alterações comportamentais importantes, caracterizadas pelo aumento na frequência do comportamento de grooming. Inicialmente esse dado, demonstra que os compostos químicos presentes no HPC induzem alterações sobre o sistema nervoso central do inseto. O grooming em insetos caracteriza-se pelo movimento de limpeza das pernas e das antenas, tendo função de comportamento de corte, sinalização social, atividade de deslocamento, excitação e limpeza (GAL e LIBERSAT, 2009). Apesar do centro neural envolvido no comportamento de grooming ainda ser desconhecido, foi demonstrado que o principal neurotransmissor associado com esta resposta é a dopamina nas antenas (LIBERSAT et al., 1999) e a octopamina nas pernas (GAL e LIBERSAT, 2010). Dessa forma, a modulação do grooming de pernas e de antenas sugere que os compostos bioativos presentes no HPC, estejam ativando

por meio de despolarização ou não, as regiões do gânglio subsofágico e supraesofágico responsáveis pela modulação do grooming em insetos (GAL e LIBERSAT, 2010).

Nossos resultados confirmam o potencial biotecnológico da alga Antártica Prasiola

crispa como um agente inseticida natural. O mecanimo da atividade entomotóxica é complexo

e envolve alterações no sistema cardiovascular, bem como sobre o sistema nervoso central e periférico do inseto. As alterações sobre o sistema nervoso central reflete-se em uma modulação complexa do comportamento do animal. As alterações sobre o sistema nervoso periférico parecem ser mais intensas, levando a uma paralizia motora progressiva e irreversível, o que provavelmente estaria associada à morte dos indivíduos por neurotoxicidade. A presença de compostos químicos esteróis no extrato e a determinação da atividade bloqueadora neuromuscular desses substratos, sugere o envolvimento dessa classe de compostos no efeito entomotóxico induzido pela Prasiola crispa. Nesse sentido, análises fitoquímicas futuras associadas a ensaios biológicos poderão identificar novos compostos presentes na alga, associados à atividade entomotóxica.

6. CONCLUSÕES

Os dados apresentados nesse trabalho e as discussões geradas apartir dos mesmos permitem elencar as seguintes conclusões:

 O extrato hexânico da alga Prasiola crispa exerce atividade entomotóxica em baratas da espécie Nauphoeta cinerea;

 A atividade da enzima colinesterase não foi alterada significativamente em homogeinizado de cérebro de barata da espécie Nauphoeta cinerea;

 O extrato hexânico de Prasiola crispa induz efeito cardiotóxico em coração de

Nauphoeta cinerea;

 O extrato hexânico de Prasiola crispa induz um bloqueio neuromuscular completo em baratas da espécie Nauphoeta cinerea sugerindo que a atividade sobre o sistema nervoso periférico seja o principal efeito tóxico desencadeado pela alga em insetos;

 O extrato hexânico de Prasiola crispa também induziu alterações comportamentais importantes demonstrando atuar também sobre o sistema nervoso central modulando o comportamento de grooming;

 A avaliação fitoquímica associada à análise bioguiada do extrato hexânico de

Prasiola crispa identificou três compostos com atividade biológica semelhante

 Dos três compostos químicos identificados o β-sitosterol foi o mais proeminente em induzir atividade neurotóxica;

 Os dados reforçam o potencial biotecnológico da alga Prasiola crispa contribuindo para validar o esforço do governo Brasileiro na manutenção do Programa de Pesquisa do continente Antártico.

7. PERSPECTIVAS

 Identificar outros compostos bioativos presentes no extrato;

 Avançar no estudo da neurotoxicidade dos insetos por meio de ensaios eletrofisiológicos;

 Avançar no estudo da neurotoxicidade induzida pelo extrato hexânico de Prasiola

crispa por meio de ensaios de Biologia Molecular e de interação droga-receptor;

8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ADLER, V. E.; UEBEL, E. C.; SCHMUTTERER, H.; ARCHES, K. R. S. Effects of Margosan-O on six species of cockroaches (Orthoptera: Blaberidae, Blattidae) and Blattellidae. In: SCHMUTTERER, H & ARCHES, K.R.S. (Eds.). Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A.). Another tropical plants. Proceedings Intern. Neem Conference, p. 387-392, 1986.

ALLISON, J. S.; LEWIS-SMITH, R. I. The vegetation of Elephant Island, South Shetland Islands. British Antartic Survey Bulletin 33/34: 185 – 212, 1973.

ATCPS. A proposal prepared by Brazil and Poland, in co-ordination with Ecuador and Peru, that AdmiraltyBay, King George Island (South Shetland Island) is designated as an Antarctic Specially Managed Area (ASMA). Twentieth Antarctic Treaty Consultative Meeting, Utrecht, 29 April – 10 May, 1996.

ÁVILA, D. S.; GUBERT, P.; PALMA, A.; COLLE, D.; ALVES, D.; NOGUEIRA, C. W.; ROCHA, J. B. T.; SOARES, F. A. A. An organotellurium compound with antioxidant activity against excitotoxic agents without neurotoxic effects in brain of rats. Brain Res Bull. v.76, p.114–123, 2008.

BASTIANETTO, S.; QUIRION, R. Natural Extracts as Possible Protective Agents of Brain Aging. Neurobiol Aging, v.23, p. 891–897, 2002.

BAUMANN, E.; GERSCH, M. Purification and identification of neurohormone D, a heart accelerating peptide from the corpora cardiaca of the cockroach Periplaneta americana; Insect Biochemistry, p. 7-14. 1982.

BELO, M.; BARBOSA, J. C.; BRAGANHOLI, D.; PEREIRA P. S.; BERTONI, B. W.; ZINGARETTI, S.; BELEBONI, R. O. Avaliação do efeito bioinseticida dos extratos de Tabernaemontana catharinensis A.DC. (Apocynaceae) e Zeyheria montana Mart. (Bignoniaceae) sobre a mosca Zaprionus indianus (Diptera: Drosophilidae) (Gupta, 1970); Revista Brasileira de Biociências, p. 235-239, 2009.

BERRY, J.; GANTAR, M.; PEREZ, M, BERRY, G.; NORIEGA, F. Cyanobacterial Toxins as Allelochemicals with Potential Applications as Algaecides, Herbicides and Insecticides; Marine Drugs, p. 117-146, 2008.

BHATT, D.; COOPER, R. L. The pharmacological and physiological profile of glutamate receptors at the Drosophila larval neuromuscular junction, Physiological Entomology, v.30, Issue 2, pages 205–210, 2005.

BOWN, A. W.; MACGREGOR, K. E., SHELP, B. J. Gamma- aminobutyrate:defense against invertebrate pest? Trends in Plant Science, 11(9): 42- 427, 2006.

BRADFORD, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem 72: 248- 254, 1976.

BRASIL. Decreto n.º 4.074 de 04 de janeiro de 2002. Regulamenta a Lei nº 7.802/89 (lei federal dos agrotóxicos). Brasília, Diário Oficial da União de 08/01/2002.

BRASIL. Lei n.º 7.802 de 12 de julho de 1989. “Lei federal dos agrotóxicos”. Brasília, Diário Oficial da União de 12/07/1989.

BRASIL. Ministério da Cultura, Pecuária e Abastecimento. Anuário Estatístico da

Agroenergia 2012. Disponível em:

http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/file/Desenvolvimento_Sustentavel/Agroenergia/anu ario_agroenergia_web_2012.pdf. Acesso em 04 oututubro 2014.

BRAVO, L. A; ULLOA, N.; ZÚNIGA, G. E; CASANOVA, A.; CORCUERA, L. J; ALBERDI, M. Cold resistance in Antarctic angiosperms. Physiologia Plantarum, v. 111, p. 55–65, 2001.

BRUFAUL, G.; CANELA, A. M.; RAFECAS, M. Physiologic and metabolic aspects related to cholesterol-lowering propertirs. Nutrition Research, New York. v. 28, n. 4, p. 217-225, 2008.

BULLANGPOTI, V., VISETSON, S., MILNE, M., MILNE, J., PORNBANLUALAP, S., SUDTHONGKONGS, C., YAYAPAT, S. The novel botanical insecticide for the control brown plant hopper. Commun Agric Appl Biol Sci. 71: 475–481. 2006.

CLIFTON, P. Plant sterol and stanols – comparison and contrasts. Steroes versus stanols in cholesterol-lowering: is there a difference? Atheroscherosis supplenents. Amsterdam, v.3, n.3, p. 5-9, 2002.

CULL-CANDY, S. G.; MILEDI, R. Junctional and extra junction al membrane channels activated by GABA in locust muscle fibres. Proc.R. Sot. Lond. 211: p. 527-535, 1981.

DAVIES, T. G. E.; FIELD, L. M.; USHERWOOD, P. N. R.; WILLIAMSON, M. S. DDT, Pyrethrins, Pyrethroids and Insect Sodium Channels.,IUBMB Life., v. 59(3): 151–162, 2007. DELPUECH, J.; BARDON, C.; BOULÉTREAU, M. Increase of the behavioral response to kairomones by the parasitoid wasp Leptopilina heterotoma surviving insecticides. Archives Environmental Contamination Toxicology 49:186-191,2005.

DOUGLAS, W. W.; PATON, W. D. M. The mechanisms of motor endplate depolarization due to a cholinesterase-inhibitory drug. J. Phy8iol. 124, 325-344, 1954.

EL-NAGAR, M. E. A.; ABDEL-SATTAR, M. M.; MOSALLAM, S. S. Toxicity of colocynithin and hydrated colocynithin from alcoholic extracts of Citrullus colocynthis pulp. J. Egypt Soc. Parasitol., v.19, n.1, p.179-185, 1989.

FRANCELINO, M. R.; PEREIRA, A. B.; FIRME, M. M.; SPIELMANN, A. A.; BREMER, U. F.; TONIN, A.; SCHAEFER, C. E. G. R. Influência da radiação solar na distribuição das comunidades vegetais nas áreas livres de gelo da Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Antártica. In: Simpósio Brasileiro de Sensoriamento Remoto, 13. (SBSR), 2007, Florianópolis. Anais. São José dos Campos: INPE, 2007. p. 2637-2642. CDROM; On-line.

ISBN 978-85-17-00031-7. 2007. Disponível em:

<http://marte.dpi.inpe.br/col/dpi.inpe.br/sbsr@80/2006/11.16.02.07/doc/2637-2642> Acesso em: 08 nov. 2014.

FERRON, F. A.; SIMÕES, J. C.; AQUINO, F. E. Série Temporal de Temperatura atmosférica para a Ilha Rei George, Antártica. Revista do Departamento de Geografia 14: 25-32. 2001. FURMANCZM, K.; OCHYRA, R. Plant communities of the Admiralty Bay (King George Island, South Shetland Islands, Antarctic) I. Jasnorszewski Gardens. Pol. Polar Res. 3(1-2): 25-39, 1982.

GAL, R.; LIBERSAT, F. A. Wasp manipulates neuronal activity in the sub-esophageal ganglion to decrease the drive for walking in its cockroach prey. Curr Biol 18(12):877–882, 2010.

GALLO, L. G.; ALLEE, L. L.; GIBSON, D. M. Insecticidal effectiveness of Mammea americana (Guttiferae) extracts on larvae of Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae) and Tricloplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae). Econ. Bot., v.50, n.2, p.236- 242, 1996.

GALLO, D.; NAKANO, O.; SILVEIRA NETO, S.; CARVALHO, R.; DE BAPTISTA, G.; BERTI FILHO, E.; PARRA, J.; ZUCCHI, R.; ALVES, S.; VENDRAMIM, J.; MARCHINI, L.; LOPES, J.; OMOTO, C. Entomologia agrícola. FEALQ. Piracicaba- SP. 10: 920. 2002. GRUE, C.; GIBERT, P.; SEELEY, M. Neurophysiological and behavioral changes in non- target wildlife exposed to organophosphate and carbamate pesticides: Thermoregulation, food consumption and reproduction. Amer Zool 37: 369-388, 1997.

GUARDIOLA, V. G.; MIGUEL, P. DE; PRIMO, E. Repellent activity against Blattella germanica of components of Schinus molle. Rev. Agroquim. Tecnol. Aliment., v.30, n.3, p.341-346, 1990.

GUEZ, D.; ZHANG, S.; SRINIVASAN, M. Methyl parathion modifies foraging behavior in honeybees (Apismellifera). Ecotoxicology 14:431-437. 2005.

GULLAN, P. J.; CRANSTON, P. S. The insects: an outline of entomology. Blackweel Publishing Ltd. Estados Unidos. 3rd Ed, 2005.

HAUBRUDGE, E.; AMICHOT, M.; CUANY, A.; BERGE, J. B.; ARNAUD, L. Purification and characterization of a carboxylesterase involved in malathion-specific resistance from Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 32: 1181- 1190. 2002.

HAY, M. E. Fish-seaweed interactions on coral reefs: effects of herbivorous fishes and adaptations of their prey. In: Sale P. F. (Ed.). The ecology of fishes on coral reefs. Academic Press, San Diego, California, p. 96-119, 1991.

HAY, M. E. Marine chemical ecology: what's know and what's next? Journal of Experimental Marine biology and ecology, 200: 103-134, 1996.

HAY, M. E.; FENICAL, W. Marine plant-herbivore interactions: the ecology of chemical defense. Ann. Rev. Ecol. Syst. 19: 111-145, 1988.

HAY, M. E.; STEINBERG, P. D., The chemical ecology of plant-herbivore interactions in marine versus terrestrial communities, Herbivores: their interactions with secondary plant metabolites, 2 ed, p. 371-413, 1992.

HICKS, K. B.; MOREAU, R. A. Phytosterols and phytostanols: functional food cholesterol busters. Food Technology, 55(1), 63–67, 2001.

HOOKER, J. D.; WILSON, W. Musci Antarctici, being characters wit brief descriptions of the new species of mosses discovered during the voyage of H. M. Discovery Ships, Erebus and Terror, in the southern circumpolar regions, together with those of Tasmania and New Zealand Lond. Journal of Botany 3: 533-556, 1844.

HU, S. S. Moss communities’ types and species diversity of Southern Fields Peninsula (King George Island, South Shetland Islands) Antarctica. J. Hattori Bot. Lab. 84: 187-198, 1998. HUBER, I.; MASLER, E. P.; RAO, B. R. CockroachesasMod- els for Neurobiology: Applications in Biomedical Research, CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 1990.

IBGE. Indicadores de Desenvolvimento Sustentável – Brasil 2012. Disponível em<ftp://geoftp.ibge.gov.br/documentos/recursos_naturais/indicadores_desenvolvimento_sust entavel/2012/ids2012.pdf> Acesso em 04 out. 2014.

ISMAN, M.B. Plant essential oils for pest and disease management. Crop Protection, v.19, p.603-8, 2000.

ITO, V. M. Concentração de Tocoferóis e Fitoesteróis apartir do destilado desodorizado de óleos vegetais através do processo de destilação molecular; Tese de Doutorade em Engenharia Quimica. Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2007.

JAMES, R. R.; XU, J. Mechanisms by which pesticides affect insect immunity. J. Invertbr. Pathol. 109(2), 175-82;2012.

KAGABU S.; ISHIHARA S.; HIEDA Y.; NISHIMURAK, A.; NARUSE, Y. Insecticidal and neuroblocking potencies of variants of the imidazolidine moiety of imidacloprid-related neonicotinoids and the relationship to partition coefficient and charge density on the pharmacophore. J. Agric. Food Chem. 55: 812-818, 2007.

KAMARAJ, C.; RAHUMAN, A. A.; BAGAVAN, A. Screening for antifeedant and larvicidal activity of plant extracts against Helicoverpa armigera (Hubner), Sylepta derogata (F.) and Anopheles stephensi (Liston); Parasitology Research 103. 1361-8, 2008.

KORNHUBER, J.; WELLER, M. Psychotogenicity and N-methyl-D-aspartate receptor antagonism: implications for neuroprotective pharmacotherapy. Biol Psychiatry, v.41, n.2, Jan 15, p.135-44, 1997.

KOVACIK, L.; PEREIRA, A. B. Green alga Prasiola crispa and its lichenized form

Mastodia tesselata in Antarctic environment: general aspects. Nova Hedwigia. Beiheft 123:

465-478. 2001.

KUBO, Y. Dual signaling is differentially activated by different active states of the metabotropic glutamate receptor 1α. University of California School of Medicine, San Francisco, CA, vol. 103 no. 4. 1124–1128, doi: 10.1073/pnas.0505925103, 2005.

KUSHWAHA V. B.; MAURYA, S. Biological utilities of Parthenium hysterophorus. Journal of Applied and Natural Science 4(1), 137–143, 2012.

LAW, M. Plant sterol and stanol margarines and health. Br. Med. J., 30, 861-864, 2000. LEWIS-SMITH, R. I. Vegetation of the South Orkney Island with particular references to Signy Island. British Antarctic Survey Scientific Reports 68: 1-124, 1972.

LIBERSAT, F. Wasp uses venom cocktail to manipulate the behavior of its cockroach prey. J. Comp. Physiol. 189: 497-508, 2003.

LIBERSAT, F.; WEISEL-EICHLERA, H. G. Venom of a parasitoid wasp induces prolonged grooming in thecockroach. The Journal of Experimental Biology. 202: 957-964, 1999.

LIMA, R. R. Informações sobre duas espécies de timbó Derris urucu (Killip et Smith) MacBride e Derris nicou (Killip et Smith) MacBride, como plantas inseticidas. Belém, EMBRAPA-CPATU, Documentos, 42, 23 p.1987.

LINDSAY, D. C. Vegetation of the South Shetland Island. Brit. Antarc. Surv. Bull. 25: 59-83, 1971.

LONGTON, R. E. Bryophyte Vegetation in Polar Regions. In: A. J. E. Smith (ed.) Bryophyte Ecology. Chapman and Hall, London, p. 122-165, 1982.

LUCHO, A. P. B.; FREITAS, T. C.; PERDOMO JR., J. D.; STURMER, G.; HEBERLE, M. H.; CORREA, M. S.; DAL BELO, C. A. Avaliação da atividade bloqueadora neuromuscular do extrato etanólico de Araucaria angustifolia . In: II SIEPE Salão Internacional de Ensino, Pesquisa e Extensão, 2010, Uruguaiana. Livro de Resumos.

MATTOS, F. J. A. Introdução a fitoquimica experimental. Fortaleza: Edições UFC, 128p, 1988.

MAYER, M. L.; G. L. WESTBROOK. The physiology of excitatory amino acids in the vertebrate central nervous system. Prog Neurobiol, v.28, n.3, p.197-276, 1987.

MC CLINTOCK J. M.; BAKER, B. J. (Eds.). Marine chemical ecology. CRC Press, p. 610, 2001.

MENDONCA, P. M.; LIMA, M. G.; ALBUQUERQUE, L. R.; CARVALHO, M. G.; QUEIROZ, M. M . Effects of latex from "Amapazeiro"Parahancornia amapa (Apocynaceae) on blowfly Chrysomya megacephala (Diptera: Calliphoridae) post-embryonic development; Veterinary Parasitology 178 379-82, 2011.

MIKOLAJCZAK, K. L.; REED, D. K.; J. CHEM. Extractives of seeds of the Meliaceae: Effects on Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), Acalymma vittatum (F.), and Artemia salina Leach. Journal of Chemical Ecology, New York, v.13, p.99-111, 1987.

MIYAZAWA, M.; ISHIKAWA, Y.; KASAHARA, H.; YAMANAKA, J.; KAMEOKA, H.; An insect growth inhibitory lignan from flower buds of Magnolia fargesii; Phytochemistry 35 611-613, 1994.

MOSTAERT, A. S.; HIGGINS, M. J.; FUKUMA, T.; RINDI, F.; JARVIS, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J Biol Phys