As análises histopatológicas foram realizadas em cortes seriados da hemiarcada desmineralizada. Para tanto, 4 dias após a inserção do dispositivo ortodôntico, os animais foram sacrificados e suas hemiarcadas removidas e fixadas em formol a 10% por 24 horas. A seguir, foram desmineralizadas por EDTA a 10%, durante, aproximadamente, 30 dias. A seguir, as hemiarcadas foram lavadas em água corrente por 24 horas e, após a inclusão em parafina, foram feitos os cortes transversais seriados de 4 μm em micrótomo apropriado. Os cortes transversais foram feitos na porção cervical das raízes do primeiro molar superior esquerdo. As lâminas obtidas foram coradas pelo método de Hematoxilina e Eosina. Para a análise microscópica da hemiarcada, foi considerada a região correspondente a face mesial da raiz mesial do primeiro molar superior direito (Fig. 3)
Figura 3:Fotomicrografia daárea desafiada para análise histológica. Corte transversal da maxila
do rato no terço cervical do primeiro molar esquerdo. No destaque estão as raízes utilizadas para análise histológica: distovestibular (DV), distolingual (DL)e intermediária (INT). Imagem obtida e modificada a partir de lâmina escaneada (Fracalossi et al., 2009).
A.1. Análise Histológica Semi-quantitativa
Foram avaliadas histologicamente, as raízes Intermediária, Disto- vestibular e Disto-lingual, considerando os aspectos inflamatórios como presença e intensidade de infiltrado celular, presença de células clásticas, além do estado de preservação do processo alveolar e cemento, diminuição do espaço do ligamento periodontal no lado de compressão, atribuindo-se escores que variaram de 0 a 4, de acordo com a intensidade dos achados (Quadro 1), baseado em Lima et al., 2000 e 2004.
A.2 Análise histomorfométrica
Realizou-se análise histomorfométrica nas raízes distovestibular, distolingual e intermediária do primeiro molar superior esquerdo do rato. Esta análise se constituiu na quantificação do percentual de áreas hialinas no ligamento periodontal nos lados de pressão de cada raiz, nos diferentes grupos. Para a quantificação utilizou-se um sistema para análise de imagem digitalizada, composto por um microscópio óptico binocular Opton XSZ-107T, com objetiva de 4X e câmera MC-130U conectados a um computador. Após a aquisição das imagens, estas foram lançadas no software Image J® para quantificação das áreas hialínicas
Com o emprego do programa Image J® contornou-se o maior perímetro radicular, desenhando uma linha coincidente com o limite mais externo do cemento. Em seguida, desenhava-se uma segunda linha contornando o trabeculado ósseo na periferia do ligamento periodontal. Este procedimento permitiu calcular a área total do ligamento periodontal. Da mesma maneira, contornou-se externamente cada área hialina no ligamento periodontal. A partir destas áreas, calculou-se o percentual (%) de área hialina no ligamento periodontal de cada raiz. (Miyoshi et al., 2001; Tomizuka et al., 2007; Von Böhl et al., 2009) (Fig. 4).
Quadro 1: Aspectos teciduais e celulares para avaliação microscópica no lado de
compressão do ligamento periodontal.
Escore 0
Ausência de áreas hialínicas Ausência de células clásticas
Espaço do ligamento periodontal uniforme Vasos sanguíneos normais
Ausência reabsorção óssea frontal
Ausência de reabsorção dentária (superfície cementária uniforme)
Escore 1
Ausência de áreas hialinas
Presença de poucas células clásticas (osteoclastos) Espaço do ligamento periodontal uniforme
Vasos sanguíneos normais e alguns congestos Ausência reabsorção óssea frontal
Ausência de reabsorção dentária (superfície cementária uniforme)
Escore 2
Pequenas áreas em processo de hialinização
Presença de clastos na superfície óssea (osteoclastos) Ligamento periodontal com espessura diminuída Vasos sanguíneos congestos e discreta hemorragia
Tecido ósseo frontal irregular com poucas cavidades reabsortivas Ausência de reabsorção dentária (superfície cementária uniforme)
Escore 3
Presença de poucas áreas hialinas
Poucos osteoclastos justapostos à superfície Ligamento periodontal com espessura diminuída Vasos sanguíneos congestos e discreta hemorragia Tecido ósseo frontal irregular com cavidades reabsortivas
Ausência de reabsorção dentária (superfície cementária uniforme)
Escore 4
Presença de grandes áreas hialinas
Osteoclastos justapostos à superfície ou nas lacunas de reabsorção Ligamento periodontal com espessura diminuída
Vasos sanguíneos congestos
Tecido ósseo frontal irregular com muitas cavidades reabsortivas Ausência de reabsorção dentária (superfície cementária uniforme)
F (A p (A Figura 4:Qu A1), e a proporcionalm Arquivo pess uantificação área hialí mente (A2) soal) de áreas hi ínica de li de (A1). A ialínicas. De igamento p quantidade etermina-se a periodontal de área hia a área total d (A2). Em alínica foi ex de ligamento seguida q xpressa em o periodontal quantifica-se percentual. l e .
A.3 Marcação imunohistoquímica de TRAP
Os cortes histológicos horizontais da maxila foram submetidos ao método da imunoperoxidase indireta empregando anticorpo policlonal para identificar a proteína tartrato-resistente à fosfatase ácida (TRAP).
Para isto, inicialmente os cortes histológicos foram coletados em lâminas silanizadas, desparafanizados em xilol e reidratados em série decrescente de alcoóis (100-70°). Estes foram lavados (3x5 minutos) em tampão fosfato de sódio (PB) 0.1M, pH 7,4, sob agitação lenta (25 rpm) e submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena empregando peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 30 minutos e lavados (5x5 minutos) com PBS.
Dando continuidade, os cortes histológicos foram incubados com solução contendo o anticorpo primário policlonal obtido em cabra anti-TRAP K17 de humano (sc30833, concentração de 1:100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), diluído em PBS acrescido de soro normal de burro (017-000-001, Jackson Immunoresearch laboratories, PA, USA), durante 24 horas a temperatura ambiente, sob agitação. Os cortes histológicos foram novamente lavados em PBS (5x5 minutos) e submetidos à segunda incubação com anticorpo secundário biotinilado anti-cabra feito em burro (705-066-147, 1:200, Jackson Immunoresearch laboratories, PA, USA), diluído em PBS acrescido de soro normal de burro durante 1 hora a temperatura ambiente, sob agitação. Os cortes histológicos foram novamente submetidos a lavagens em PBS (5x5 minutos) e incubados em estreptavidina conjugada com peroxidase (1:200, Kit ABC, PK6100, Vector Laboratories, CA, USA) diluído em solução de PB a temperatura ambiente, durante 1 hora. A revelação da reação de imunoperoxidase foi realizada em solução de PBS acrescido com diamobenzidina (0,005%), seguido de inativação através de inúmeras lavagens em PBS.
Estes cortes histológicos foram contra-corados com hematoxilina de Harris, desidratados, diafanizados em xilol e montados com meio de montagem hidrofóbico (Erv-mount, Erviegas, SP, Brasil).
Todas as reações de imunoperoxidase foram acompanhadas por um controle negativo, através da omissão do anticorpo primário ou secundário, seguido dos demais procedimentos citados anteriormente.