Análise in vitro vs in silico

Encontram-se descritas mais de 1300 alterações no gene LDLR como causadoras de FH (Usifo et al. 2012), dado que aproximadamente 55% são alterações missense e apenas uma parte destas alterações apresentam estudos funcionais comprovando a sua patogenicidade (Leigh et al. 2008; Usifo et al. 2012). Os estudos funcionais são importantes para a comprovação da patogenicidade das alterações, uma vez que a previsão in silico não é suficiente para se aferir sobre a patogenicidade das mesmas e deve ser utilizada com o máximo cuidado. Para um indivíduo com diagnóstico clínico de FH é extramente importante identificar a causa genética da hipercolesterolemia, uma vez que quando identificada a mutação como causadora de FH é necessário a introdução adequada da terapêutica farmacológica, usualmente uma estatina pote nte ou a combinação de terapêuticas de modo a que os doentes atinjam os alvos terapêuticos desejados. A identificação precoce de crianças com FH é também uma grande vantage m uma vez que estas crianças irão ser acompanhadas por um pediatra que irá implementar

uma dieta rígida e implementação de terapêutica farmacológica adequada, usualmente a partir dos 8 anos de forma a reduzir o risco de desenvolverem uma doença cardiovascular prematura (DeMott et al. 2008; NICE 2008; Nordestgaard et al. 2013). Na impossibilidade da realização de estudos funcionais a todas as alterações encontradas no EPHF, foi elaborada uma classificação para as alterações cuja patogenicidade era desconhecida de modo a avaliar o seu significado clínico (Figura IV.1). De forma a validar a classificação proposta neste trabalho, foi realizada uma comparação in silico vs in vitro tendo-se verificado que a previsão in silico classificou corretamente 81,5% das alterações missense e 100% das alterações de splicing. No ano de 2012 os responsáveis pela base de dados internacional de mutações na FH (Usifo et

al. 2012) realizaram um estudo semelhante com base em 10 programas bioinformáticos,

classificando 223 alterações reportadas à base de dados, tendo verificado que 79% destas alterações eram possivelmente a causa da doença. No entanto, alguns dos programas bioinformáticos utilizados por estes autores já não se encontram disponíveis

online, impedindo a aplicação dos mesmos critérios utilizados por estes autores.

A análise in silico para as alterações missense reportadas neste trabalho foi realizada com base em 6 programas bioinformáticos que originam uma previsão do efeito da alteração na proteína, tendo por base a alteração do nucleótido, aminoácido, bem como a conservação entre espécies. O efeito do correto processamento do pré-mRNA para as alterações de splicing foi analisado em 3 programas bioinformáticos. Após a previsão in

silico das alterações sem estudos funcionais classificou-se 36 alterações:19 prováveis, 7

possíveis e 10 neutras.

A análise in silico origina uma previsão do efeito que a alteração originará na proteína, contudo os programas bioinformáticos não conseguem prever com e xatidão o efeito real que a alteração causará na proteína. Para algumas proteínas, como é o caso da APOB o resultado in silico deve ser interpretado ainda com mais atenção, uma vez que esta proteína nunca se encontra livre na circulação sendo difícil obter-se a sua estrutura cristalina (Prassl and Laggner 2009). O avanço tecnológico permitiu melhorar significativamente os programas de previsão bioinformáticos, desenvolvendo novos programas com abordagens de análises diferentes originado uma melhor previsão do efeito da alteração na proteína. Como descrito neste trabalho, após a análise nos programas bioinformáticos, a alteração p.Gly76Trp foi classificada como patogénica, tendo o estudo funcional comprovado o contrário. Neste caso e sempre que possível o

melhor indicador é a observação da co-segregação da alteração com a hipercolesterolemia na família. Contudo a obtenção de familiares nem sempre é um processo fácil o que dificulta este tipo de análise.

Encontra-se descrita na literatura que a prevalência de FH é 1 em 500 na maioria das populações. No entanto foi reportado recentemente que esta prevalência poderia ser de 1 em 200 na Holanda e Noruega (Nordestgaard et al. 2013). Esta prevalência foi calculada com base nos indivíduos identificados nestes países, onde existe a maior taxa de indivíduos identificados com FH em todo o mundo. Nestes países foi desenvolvido, em conjunto com os ministérios da saúde de cada país, um estudo nacional para a identificação clínica e molecular destes doentes bem como comparticipação do respetivo tratamento e aconselhamento de CI e familiares com FH (Fouchier et al. 2001; Nordestgaard et al. 2013). No entanto, nestas populações, uma grande parte das alterações reportadas não tem estudos funcionais que comprovem a sua patogenicidade (Fouchier et al. 2005; Huijgen et al. 2010; Usifo et al. 2012). A não realização do estudo funcional pode estar na origem de uma prevalência diferente da verificada na maioria das populações.

Na Holanda, devido ao grande número de indivíduos identificados (73%), foi desenvolvida uma abordagem baseada em critérios de classificação para alterações com patogenicidade desconhecida, com base na co-segregação das alterações nas famílias, valores de cLDL antes e após iniciação da terapêutica farmacológica, bem como a resposta à mesma e na presença de DCV nos indivíduos com FH (Huijgen et al. 2010; Huijgen et al. 2012). Contudo, este tipo de abordagem apenas funciona em cohorts onde existe um grande número de indivíduos estudados e identificados na mesma família. Uma das maiores limitações encontradas durante este trabalho de doutoramento foi a angariação de familiares para uma informação completa da história clínica da família tendo sido complicado, na maioria dos casos, realizar uma avaliação clara e objetiva quanto à patogenicidade das alterações. A análise in silico deve ser considerada informativa e utilizada como ferramenta para melhorar classificar as alterações mas não deverá nunca ser conclusiva.