Análise laboratorial

A metodologia utilizada foi a recomendada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA (1995) com algumas modificações. De cada ave foi coletado um suabe de cloaca; cada suabe era colocado em um tubo contendo o meio de transporte Stuart (Oxoid) até a chegada das amostras ao laboratório de microbiologia. O meio de transporte Stuart (Oxoid) utilizado para o transporte das amostras apresenta a seguinte composição: glicerofosfato de sódio (10,0 gramas/litro ou g/l), tioglicolato de sódio (0,5 g/l), cisteína hidroclorada (0,5 g/l), cloreto de cálcio (0,1 g/l), azul de metileno (0,001 g/l) e ágar (5,0 g/l). O pH do meio é 7,4 ± 0,2. No preparo do meio foi adicionado 16 gramas para cada um litro de água destilada; após o preparo, os tubos contendo cinco mililitros de meio Stuart (Oxoid) foram autoclavados a 121o C por 15 minutos. Na pesagem dos meios foi utilizada balança analítica Marte, na medição de pH, o pHmêtro VWR Scientific, na incubação a estufa 37o C Quimis e na esterilização dos meios, o autoclave Phoenix.

Após a chegada, os suabes eram repassados para tubos individuais de Rappaport Vassiliadis (Acumedia) e ficavam incubados na estufa de 37o C por aproximadamente 48 horas. Cada litro de Rappaport- Vassiliadis (Acumedia) foi preparado da seguinte maneira: caseína enzimática (4,54 gramas), cloreto de sódio (7,20 gramas), fosfato dihidrogenado de potássio (1,45 gramas), cloreto de magnésio anidro (13,4 gramas), verde malaquita oxalato (0,036 grama). O pH é de 5,1 ± 0,2; e para cada 26,6 gramas de meio foi adicionado um litro de água destilada. Em cada

tubo foram colocados cinco mililitros e posteriormente foram autoclavados a 116o C por 15 minutos.

Foto 1: Rappaport-Vassiliadis; à direita, o meio antes de ser incubado com o suabe cloacal, os demais foram incubados por 48 horas a 37o C.

Depois, eram repicados no ágar MacConkey (Acumedia) e permaneciam na estufa 37o _{C por 24 horas.}

Foto 2: ágar MacConkey; colônias de bactérias que consomem a lactose (róseas) e algumas colônias não consumidoras de lactose (transparentes a beges).

O ágar MacConkey (Acumedia) que foi utilizado no plaqueamento era composto de: ágar (13,5 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l), cristal

violeta (0,001 g/l), lactose (10,0 g/l), peptona de carne (1,5 g/l), peptona de caseína (1,5 g/l), peptona de gelatina (17,0 g/l), sais biliares (1,5 g/l), vermelho neutro (0,03 g/l). O pH final tinha o valor de 7,1 ± 0,2 a 25 o C; para cada litro de água destilada são adicionados 50 gramas do meio, posteriormente autoclavado a 121o C por 15 minutos e depois foi transferido para as placas dentro da capela de fluxo laminar. Em cada placa de 7,5 centímetros de diâmetro são distribuídos 15 ml e nas placas de 9,0 centímetros de diâmetro (placas que podiam ser divididas e plaquear dois materiais diferentes) foram colocados 20 ml do meio.

O ágar MacConkey possui a lactose como açúcar fermentável, portanto bactérias que fermentam a lactose possuem colônias rosas no meio, enquanto que as não fermentadoras de lactose atacam a peptona (fonte de nitrogênio), resultando metabólitos alcalinos e ficam transparentes ou cor palha (QUINN et al, 1994). Como inibidores de outros microorganismos, possui sais biliares e cristal violeta (BIER, 1976 e QUINN et al, 1994).

Após esse período, as colônias típicas de salmonela eram repicadas no ágar tríplice açúcar ferro ou TSI (Merck). Para o preparo deste meio foram adicionados 65 gramas em um litro de água destilada; a composição por litro era a seguinte: peptona de caseína (15,0 g/l), peptona de carne (5,0 g/l), extrato de carne (3,0 g/l), extrato de levedura (3,0 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l), lactose (10,0 g/l), sacarose (10,0 g/l), D-glicose (1,0 g/l), citrato de amônio e ferro III (0,5 g/l), tiossulfato sódico (0,5 g/l), vermelho de fenol (0,024 g/l) e ágar (12,0 g/l). O pH final deve ficar em 7,4 ± 0,2 a 25o _{C e em} cada tubo foram distribuídos três mililitros, posteriormente autoclavados a 121o C por 15 minutos.

Foto 3: TSI; meios de coloração negra indicam a produção de H2S (os dois tubos mais à esquerda), produção de gás (os três tubos mais à direita), dos resultados possíveis para as salmonelas estão os três tubos mais à esquerda.

O princípio do TSI é a fermentação da glicose, da lactose e da sacarose, bem como a produção de sulfeto de hidrogênio ou H2S (ANVISA, 2004). Em meio contendo peptona, as bactérias reduzem o enxofre por hidrogenação, com a produção de H2S que se liga aos íons férricos e formam o sulfato ferroso em precipitado negro insolúvel (OLIVEIRA, 2000). Se a bactéria fermenta apenas a glicose, ocorre reação ácida no fundo do tubo, dando cor amarela e reação alcalina na superfície de cor vermelha; no entanto, se a bactéria fermenta a glicose e a lactose e/ou a sacarose (dois ou três açúcares), acontece uma reação ácida em todo o meio, ficando todo ele amarelo (ANVISA, 2004). A produção de gás é evidenciada com o acúmulo deste no fundo do tubo e a produção de H2S torna o meio enegrecido. Se não ocorre a fermentação dos açúcares, a cor do meio permanece inalterada, ou seja, vermelha (OLIVEIRA, 2000).

Dos resultados possíveis do TSI, os característicos para salmonelas eram repassados para três testes: fenilalanina (Micromed), vermelho de metila/Vogues Proskaeur ou VM/VP (Merck) e indol - preparado de acordo com OLIVEIRA (2000), da seguinte maneira: 0,5 gramas de cloreto de sódio (Dinâmica), 1,0 grama de L-triptofano (Vetec), 1,5 gramas de neopeptona (Difco) e 100 mililitros de água destilada.

O ágar fenilalanina (Micromed) é preparado adicionando-se 26 gramas do meio em um litro de água destilada. Cada litro era composto por: L- fenilalanina (2,0 g), cloreto de sódio (5,0 g), fosfato dissódico (1,0g), ágar (15,0 g) e extrato de levedura (3,0 g). O pH a 25o C ficou em 7,0 ± 0,2. Para preparar o meio foi necessário adicionar 26 gramas em um litro de água destilada. Em cada tubo foram colocados três mililitros, que posteriormente são autoclavados a 121o C por 15 minutos. Segundo OLIVEIRA (2000), esse ágar analisa a propriedade de algumas bactérias transformarem felilalanina em ácido fenilpirúvico, que é uma característica do gênero Proteus. Após a incubação em estufa a 37o C por cerca de 18 a 24 horas, foi necessário pingar 0,2 mililitros de cloreto férrico a 10% (Vetec) sobre o cultivo, se a cor mudava para verde, indicaria positividade.

Foto 4: ágar fenilalanina; resultado verde (à esquerda) indica positividade.

O meio VM/VP (Merck) tinha a seguinte composição em cada litro: peptona de carne (7,0 g), D-glicose (5,0 g) e tampão fosfato (5,0 g). Foram colocados 17 gramas do meio em um litro de água destilada, com pH final de 6,9 ± 0,2 a 25o _{C. Em cada tubo foram colocados três mililitros do} preparo e autoclavados a 121o C por 15 minutos. De acordo com OLIVEIRA (2000), o teste é baseado no indicador VM para determinação do pH se a

bactéria fermenta a glicose, sendo que todos os membros da família Enterobacteriaceae o fazem. Neste caldo, após 18 a 24 horas, ocorre a produção de metabólitos ácidos, devido à fermentação. Para a leitura do teste VM, foi necessário pingar duas a três gotas da seguinte solução, que era assim preparada: 0,1 g de vermelho de metila, 300 ml de álcool etílico a 95% e completar até 500 ml com água destilada. Se for positivo seria observada uma coloração vermelha, se for negativo, cor amarela. O VP mede a produção de acetilmetilcarbinol oriundo da fermentação da glicose; para realizar o teste, basta após a execução do teste VM, no mesmo tubo adicionar 0,6 ml de solução alfa-naftol a 5% (Vetec) e 0,2 ml de solução aquosa de KOH a 40%. Na medição das soluções a serem adicionadas ao teste, foram utilizadas micropipetas de 2,0 ml da Pipetman.

Foto 5: VM/VP; teste do VM, positivo (à esquerda) e negativo (à direita).

O indol é resultante da degradação do triptofano por certas bactérias, que com a adição dos reagentes, produz coloração avermelhada. Primeiramente é adicionado um mililitro de xilol e, posteriormente, 0,5 ml de Reativo de Erlich (fórmula: 1,0 g dep-dimetilaminobenzaldeído, 95,0 ml de álcool etílico absoluto e 20,0 ml de ácido clorídrico concentrado) nas paredes do tubo. Se for positivo, haverá a formação de um “anel” vermelho debaixo do indol acumulado pelo xilol; reação negativa tem o “anel” incolor (OLIVEIRA, 2000).

Foto 6: indol; à esquerda, resultado positivo e à direita, negativo.

Segundo o MAPA (1995), as salmonelas são negativas para a fenilalanina, para o indol e para o VP, e são positivas para o VM.

Apenas as amostras com resultados negativos na fenilalanina, indol e VP, e positivo para o VM eram repassados para os outros bioquímicos: arginina (Merck), citrato de Simmons (Bencton Dickinson), glicose (Sigma), lactose (Merck), lisina (Isofar), malonato (Merck), manitol (Inlab), motilidade - meio motilium (Difco), ornitina (Sigma), sacarose (Sigma), salicina (Difco) e sorbitol (Vetec). Os resultados para esses testes variam de acordo com os diferentes sorotipos de Salmonella, sendo utilizado para a interpretação dos resultados, o preconizado por MAPA (1995) e por OLIVEIRA (2000). Nesta fase também eram utilizados os anti-soros Salmonella polivalente e somático (Probac).

Os açúcares, ou seja, glicose, lactose, manitol, sacarose, salicina e sorbitol tem todos a mesma base para açúcares, preparada de acordo com OLIVEIRA (2000):

__10,0 g de peptona, sendo utilizada a neopeptona (Difco), __1,0 g de extrato de carne (Oxoid),

__5,0 g de cloreto de sódio (Dinâmica),

__0,018 g de indicador de Andrade, que tem a seguinte composição: 5,0 g de fucsina ácida (Quimibrás), 150 ml de hidróxido de sódio (Vetec ou Dinâmica) e 1000 ml de água destilada,

__1000 ml de água destilada,

__o açúcar foi adicionado na proporção de 1% a esta solução acima descrita, exceto a salicina na proporção de 0,5%.

Em cada tubo foram colocados três mililitros do preparado e um tubo de Durham invertido, depois autoclavados a 121o C por 15 minutos. Depois de inoculada a amostra da bactéria, o meio permanecia na estufa 37o C por 18 a 24 horas. O meio tem coloração rosa clara, e no caso de um resultado positivo, tem cor rosa mais escuro que o original.

Foto 7: salicina (açúcar); à esquerda, positivo, à direita, negativo.

A composição do Citrato de Simmons (Bencton Dickinson) utilizado foi: fosfato dihidrogenado de amônio (1,0 g/l), fosfato dipotássico (1,0 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l), citrato de sódio (2,0 g/l), sulfato de magnésio (0,2 g/l), ágar (15,0 g/l) e azul de bromotimol (0,08 g/l). Para cada litro de água destilada, adicionaram-se 24,2 gramas do ágar Citrato de Simmons (Bencton Dickinson). O pH deveria ficar em 6,9 ± 0,2 e depois de colocar cerca de três

mililitros do meio em cada tubo, estes foram autoclavados por 15 minutos a 121o C. As bactérias que conseguem utilizar o citrato como fonte única de carbono crescem neste meio, alterando a cor original que é verde, para o azul.

Foto 8: citrato de Simmons; à esquerda, resultado positivo, os demais são negativos (cor original do meio permanece inalterada).

Para o preparo dos aminoácidos arginina, lisina e ornitina foi utilizada a mesma base, preparada de acordo com MERCK: 5,0 g/l de peptona de carne (Vetec), 3,0 g/l de extrato de levedura (Difco), 1,0 g/l de glicose (Sigma), 0,016 g/l de púrpura de bromocresol (BDH Chemicals) e completada com água destilada para um litro. Posteriormente, com esta base pronta, cada aminoácido era colocado na proporção de 1% (exemplo: para o preparo da arginina, era adicionado 1% da mesma à base). O pH deveria ficar ajustado em 6,7 ± 0,2. Em cada tubo foram colocados três mililitros do meio; depois esterilizados a 121o C por 15 minutos. Segundo OLIVEIRA (2000), após a inoculação das bactérias nos tubos, estes devem ter parafina (no caso deste trabalho foi utilizado óleo) e ficar incubado por quatro dias. O meio muda de cor para o amarelo (inicialmente são violetas) devido à produção de ácido oriundo do consumo de glicose. Se ocorre a descarboxilação (pelo consumo do aminoácido), posteriormente o meio se torna novamente violeta. Para cada aminoácido testado, deve se ter o controle (que tem apenas a base comum para os aminoácidos) que sempre fica amarelo.

Foto 9: arginina (aminoácido); à esquerda, resultado positivo, à direita, resultado negativo e no meio, cor original do meio.

O protocolo utilizado para o preparo do malonato foi o mesmo seguido por OLIVEIRA (2000), como a seguir: extrato de levedura (1,0 g), sulfato de amônio (2,0 g), fosfato duplo de potássio (0,6 g), fosfato monopotássico (0,4 g), cloreto de sódio (2,0 g), malonato de sódio (3,0 g), glicose (0,25 g), azul de bromotimol (0,025 g) e água destilada (1000 ml). O pH deveria ficar entorno de 6,7. Em cada tubo foram colocados três mililitros do preparado, posteriormente autoclavados a 121o C por 15 minutos. O meio fica incubado a 37o C por 24 horas. Segundo a ANVISA (2004), este teste serve para verificar se um microorganismo consegue utilizar o malonato de sódio como única fonte de carbono, o que gera a alcalinização do meio. A interpretação do teste: se for positivo, fica azul, se for negativo, fica verde (cor do meio preparado).

Foto 10: malonato; positivo (à esquerda), negativo (à direita).

A finalidade do teste de motilidade é observar se a bactéria é móvel ou não. Para isso, inocula-se verticalmente a bactéria com o uso de um fio bacteriológico, perfurando lentamente o meio. Dessa forma, os microorganismos móveis migram pela linha do inoculado e geram turvamento do meio, enquanto que os imóveis crescem apenas na linha do inoculado, o restante do meio permanece inalterado ou límpido (ANVISA, 2004). O meio utilizado para observar a motilidade foi o Motilium (Difco) que é composto de: bactotriptose (10,0 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l) e ágar bacteriológico (5,0 g/l). Para o preparo foi necessário adicionar 20 gramas em um litro de água destilada, o pH deveria ficar em 7,2 ± 0,2 e deve-se distribuir três mililitros em cada tubo; posteriormente, autoclavar por 15 minutos a 121o C. O meio inoculado deveria permanecer por 18 a 24 horas em estufa a 37oC.

2.1) Resumo do esquema utilizado no trabalho

Suabe cloacal coletado e transportado em meio de transporte Stuart

Rappaport-Vassiliadis (24-48 horas a 37o C)

MacConkey (18-24 horas a 37o C)

Colônias Típicas de Salmonella Colônias Não-Típicas de Salmonella

NÃO é SALMONELLA

TSI (18 a 24 horas a 37o _{C) resultados não típicos}

de Salmonella

Resultados típicos de Salmonella

Tipificação na Fundação Indol, Fenilalanina e VM/VP Oswaldo Cruz

Resultados típicos de Salmonella

Muitos resultados Demais Testes bioquímicos e Compatíveis Anti-soro Salmonella polivalente flagelar e somático p/ Salmonella