Análise de mediadores inflamatórios

Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)

A atividade de MPO, uma enzima encontrada nos grânulos azurófilos de neutrófilos, é utilizada como marcador da presença de neutrófilos no tecido inflamado. Amostras de feridas incisionais e excisionais foram utilizadas para determinação de atividade da enzima mieloperoxidase nos diferentes tempos de seguimento experimental (SOUZA et al., 2001). Os tecidos coletados foram incubados em solução de HTAB 0,5% (Brometo de hexadeciltrimetilamonio) na proporção de 50 mg de tecido por mL, homogeneizados em POLITRON® _e centrifugados (1500 g/15 min a 4oC). O sobrenadante obtido foi transferido para um epperdorf e submetido ao choque térmico no pellet de células em três etapas de congelamento e descongelamento (- 20°C; 10 minutos cada). O sobrenadante foi novamente homogeneizado e centrifugado (1500 x g; 15 min a 4o_{C) para melhor} remoção de contaminantes. Em seguida, as amostras foram plaqueadas (duplicatas de 7 L em placas de 96 poços) e adicionado 200 L da solução de leitura (5 mg O- dianisidine; 15 L H2O2 1%; 3 mL tampão fosfato; 27 mL H2O). A leitura da absorbância foi obtida a 460 nm (to=0 min e t1=1 min) em leitor de ELISA. A

mudança na absorbância foi plotada em uma curva padrão de neutrófilos, expressa como neutrófilos/mg de tecido e interpretada como atividade da enzima mieloperoxidase.

Determinação dos níveis de nitrato/nitrito (NO3-_/NO2-₎

Amostras de feridas incisionais provenientes dos dias 2 e 7 após a cirurgia foram utilizados para determinação conteúdo total de nitrato/nitrito (NO3-/NO2-) pela reação de Griess como um indicador da produção de óxido nítrico (CHEN et al., 2000). Em seguida, amostras do tecido neoformado foram coletadas, pesadas, homogeneizadas com auxílio de um POLITRON® em uma solução resfriada de cloreto de potássio (KCl) a 1,15% (homogenato a 10%) e centrifugados (1500 x g; 15 minutos) para obtenção do sobrenadante. O sobrenadante do macerado foi plaqueados (placas de 96 poços) em duplicata (80 L de cada amostra) e incubados em uma solução (0,04 mL de nitrato redutase, NADPH, KH2PO4 e água destilada) por 12 horas para que o NO3– das amostras fosse convertido em NO2-. No dia subseqüente, uma curva-padrão de referência de NO2–_{, apartir de uma diluição} seriada de uma solução de NaNO2 foi preparada e plaqueada. Foram adicionados 80 L da solução de Griess (1% de sufanilamida em 1% H3PO4/ 0,1% de N-1-nafitil- etilenodiamina dihidrocloreto/águadestilada/1:1:1:1) em cada poço. A coloração púrpura/magenta foi medida em leitor de ELISA com filtro de 540 nm. Os valores obtidos para as amostras experimentais foram plotados com curva padrão e expressos em µM de NO2-.

Dosagem in situ de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF- )

Amostras de feridas incisionais e excisionais foram coletadas no dia 2 após a cirurgia, conforme descrito anteriormente, para dosagem de IL-1 e TNF- . O tecido coletado foi homogeneizado em solução de PBS e processado como descrito por Safieh - Garabedian et al. (1995). A detecção de IL-1 e TNF- foi determinada no sobrenadante do macerado da amostra por ELISA (CUNHA et al., 1993). Placas de 96 poços foram incubadas por 12h a 4oC com anticorpo anti-IL-1 ou anti- TNF- murino (4 g/mL ou 0,8 g/mL; kit da R&D systems- Cat. Nº DY501 ou DY510,

respectivamente). Após sensibilização das placas, as amostras foram adicionadas em duplicata e a curva padrão foi adicionada em várias diluições e incubadas por 24h a 4 oC. As placas foram então lavadas três vezes com solução tampão PBS/Tween-20 (0,05% SIGMA) e incubadas com anticorpo monoclonal biotinilado anti- IL-1 ou anti- TNF- diluídos (1:1000 com BSA/Tween 1%). Após o período de incubação à temperatura ambiente por 1h, as placas foram lavadas e 50 L do complexo HRP-avidina diluído 1:5000 foram adicionados. Decorridos 15 minutos, o reagente de cor o-fenilenodiamina (OPD, 50 L) foi adicionado e as placas foram incubadas na ausência de luz a 37 oC por 15 a 20 min. A reação enzimática foi interrompida com H2SO4 (1M) e a densidade óptica medida a 490 nm em espectrofotômetro. As concentrações de citocinas contidas nas amostras foram calculadas a partir de uma curva padrão com 11 pontos, obtida por diluição seriada, sendo as concentrações iniciais de 2000 pg/mL para TNF- ou 4000 pg/mL para IL- 1 . Os resultados foram expressos em picograma de citocinas/mL de sobrenadante/mg de tecido.

Determinação de TNF-α e IL-1 no sobrenadante de cultura de macrófagos estimulado com a fração protéicas do látex de C. procera (PL)

Objetivando investigar se a indução na liberação de TNF-α e IL-1 pela BioMem PVA/PL em feridas incisionais e excisionais seria através da estimulação de PL sobre macrófagos residentes, foi realizada esta abordagem experimental.

Para tanto, macrófagos (MØs) peritoneais foram obtidos de camundongos saudáveis seguindo o método descrito por Cunha; Ferreira (1986). Para isto, os animais foram tratados por via intraperitoneal com 2 mL de tioglicolato a 4% em água destilada. Após quatro dias, foi administrado por via intraperitoneal 3 mL do meio RPMI heparinizado, pH 7,4 e os animais sacrificados para coleta do exsudato peritoneal em condições estéreis. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em RPMI por centrifugação a 100 x g durante 5 minutos. O precipitado final foi ressuspenso em 1 mL de RPMI, sendo então diluído (1:20) em solução de Turk para contagem total das células em câmara de Neubauer. As células foram ressuspensas em RPMI, na concentração de 2 x 106 células /mL e distribuídas em placas de cultura de 24 poços (1 mL/poço).

Para aderência dos macrófagos, a placa foi incubada por 1 hora em estufa de CO2 a 5%. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e as células aderidas (95% de macrófagos) foram lavadas três vezes com RPMI, sendo incubadas novamente por 12 horas em CO2 a 5%. Após esse período, as células foram novamente lavadas com RPMI e incubadas como a seguir: RPMI (controle negativo), LPS (1µg/mL; controle positivo) e proteínas do látex de Calotropis procera (500 µg/mL). Após 5 horas de incubação, os sobrenadantes da cultura de macrófagos foram coletados e utilizados para dosagem de TNF-α e IL-1 através do método ELISA (“enzime-linked immunosorbent assay”). A viabilidade celular foi avaliada pela técnica de exclusão com azul de Trypan.

4.8 Avaliação da densidade vascular ao tecido neoformado de feridas