Análise microbiológica

4.6.1 Extração do DNA das cepas controle para identificação e genotipagem de P.gingivalis

Como controle positivo, foi utilizado DNA cromossômico das seguintes amostras de P.gingivalis: W83 para detecção de P. gingivalis e genótipo rag B, HW24D-1 para detecção do genótipo fimA II e HG564 para detecção do genótipo fimA IV.

Alíquotas do estoque congelado de cada uma das cepas em 20% de glicerol em freezer –80°C foram inoculadas em placas de ágar Brucella sangue. As placas foram incubadas sob condições de anaerobiose, durante o período de 10 a 15 dias a 37°C, em câmara de anaerobiose (Plas Lab, Lansing, MI, EUA) em atmosfera de 85% N2, 5% CO2 e 10% H2 (Oxilumen, São Paulo, Brasil).

Após o desenvolvimento das culturas de P.gingivalis, as colônias foram suspensas com auxílio de alças plásticas padronizadas de 1μl em 300μl de água milliQ estéril em microtubos de centrífuga de 1,5ml. A extração do DNA foi realizada de acordo com o método descrito por Teanpaisan; Douglas (1999). A lise das células foi realizada por imersão dos microtubos por 10 minutos em água fervente, seguindo-se centrifugação por 10 min/ 10.000xg/ 4°C. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo de centrífuga e armazenado em freezer -20°C (TEANPAISAN; DOUGLAS, 1999).

Em microtubo de centrífuga de 0,2ml foi adicionado 8,8μl de cada amostra em TE pH 7,6, 1μl de Tween 20 a 5% e 0,2μl de Proteinase K a 10mg/ml. Cada microtubo devidamente identificado foi inserido em termociclador e incubado a 55oC por 2 horas e 95oC por 10min. (DEWHIRST et al., 2000). O DNA purificado foi estocado a -20 oC.

4.6.3 Detecção da presença de P. gingivalis

Para determinar a presença de P.gingivalis, o DNA das amostras foi submetido à amplificação da região 16S rRNA, através da utilização de iniciadores espécie-específicos, homólogos a seqüência de 16S rRNA de P. gingivalis descritos por Amano et al. (1999) e Amano et al. (2000) cuja seqüência é apresentada na tabela 4.1.

Para cada reação de amplificação foram utilizados 8,75μl de água miliQ; 2,5μl de solução tampão (10x PCR buffer); 0,5μl de solução estoque 10mM de cada dNTP (Invitrogen, São Paulo, Brasil); 0,75μl de MgCl2 cuja concentração foi otimizada para 1,5 mM; 0,25μl de cada Primer (iniciador) (25 pM); 0,5μl de Taq DNA Polymerase (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil); e 1,5μl de DNA de cada amostra dos pacientes, totalizando de 15μl de reação.

As reações de amplificação foram realizadas em termociclador (Applied Byosistems, São Paulo, Brasil) com desnaturação inicial a 95oC por 5 min, seguindo-

se 30 ciclos de 94oC por 30 seg., 58oC por 30 seg., 72oC por 30 seg. e um ciclo de extensão final a 72oC por 7 minutos (AMANO et al., 1999).

Controles negativos e positivos foram incluídos em cada lote de amostras analisadas. O controle negativo foi constituído da mistura padrão de PCR com adição de 1,5μl de água miliQ, e o controle positivo foi obtido utilizando-se a mistura padrão de PCR acrescida da mesma quantidade (1,5μl) de DNA molde da cepa P. gingivalis W83, originando um produto de 197bp.

Todos os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5%, em tampão Tris Acetato EDTA (TAE - Tris acetato 40mM, pH 8,5; EDTA 2mM) e corados com brometo de etídio. Os fragmentos específicos de 197bp, correspondentes à detecção de DNA de P. gingivalis foram visualizados e documentados sob luz ultravioleta em transiluminador (Pharmacia Biotech, San Francisco, USA).

Tabela 4.1. Seqüências dos iniciadores utilizados para determinação de P.gingivalis, fímbrias do tipo fimA II, fimA IV e do gene ragB e seus respectivos tamanhos do produto esperado (AMANO et al., 1999 e 2000; NAKAGAWA et al., 2002; HANLEY et al., 1999)

Gene Iniciadores Seqüência nucleotídica (5’ - 3’)

Produto esperado (pb) P.gingivalis rRNA Pg rRNAf Pg rRNAr

5´TGT AGA TGA CTG ATG GTG AAA ACC 3´ 5´ACG TCA TCC CCA CCT TCC TC 3´ 197 FimA II fimA II upper

fimA II lower

5´ACA ACT ATA CTT ATG ACA ATG G 3´

5´AAC CCC GCT CCC TGT ATT CCG A 3´ 257 FimA IV fimA IV upper

fimA IV lower

5´ CTA TTC AGG TGC TAT TAC CCA A ´3

5´ AAC CCC GCT CCC TGT ATT CCG A ´3 251

Operon ragAB

ragB2

5´- GAC TCT TGG CTC GTT TAC TG-3´

5´ACG CAA ACG ACT ACC CTC A-3' 436

4.6.4 Análise da presença do gene fimA II nas amostras P. gingivalis positivas

Nas amostras P. gingivalis positivas, foi realizada a detecção do gene fimA II. Para cada reação de amplificação foram utilizados 8,75μl de água miliQ; 2,5μl de solução tampão (10x PCR buffer); 0,5μl de solução estoque 50mM de cada dNTP (Invitrogen, São Paulo, Brasil); 0,75μl de MgCl2 cuja concentração foi otimizada para 1,5 mM; 0,25μl (100 pmol de cada Primer - 25 pM); 0,5μl de Taq DNA Polymerase (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil); 0,25μl de BSA (Biotools, New

England, USA) (ROEUX, 2003; STOMMEL et al., 1997); e 1,5μl de DNA de cada amostra dos pacientes, totalizando de 15μl de reação. As reações de amplificação foram realizadas com um ciclo inicial de 95oC por 5 min, seguidas por 30 ciclos de 94oC por 30s, 58oC por 30s, 72oC por 30s e extensão final a 72oC por 7 minutos (AMANO et al., 1999; AMANO et al., 2000). DNA da amostra padrão HW24D-1 que apresenta o genótipo fimA tipo II foi submetido a reação de amplificação como controle positivo, originando um produto de 257bp. Para o controle negativo, foi adicionada 1,5μl de água miliQ.

4.6.5 Análise da presença do gene fimA IV nas amostras P. gingivalis positivas

Nas amostras P. gingivalis positivas, foi realizada a detecção do gene fimA IV. Para cada reação de amplificação foram utilizados 8,75μl de água miliQ; 2,5μl de solução tampão (10x PCR buffer); 0,5μl de solução estoque 50mM de cada dNTP (Invitrogen, São Paulo, Brasil); 0,75μl de MgCl2 cuja concentração foi otimizada para 1,5 mM; 0,25μl (100 pmol de cada Primer - 25 pM); 0,5μl de Taq DNA Polymerase (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil); 0,25μl de BSA (Biotools, New England, USA); e 1,5μl de DNA de cada amostra dos pacientes, totalizando de 15μl de reação. As reações de amplificação foram realizadas com um ciclo inicial de 95oC por 5 min, seguidas por 30 ciclos de 94oC por 30s, 58oC por 30s, 72oC por 30s e extensão final a 72oC por 7 minutos (AMANO et al., 1999). DNA da amostra padrão

HG564 que apresenta o genótipo fimA tipo IV foi submetido a reação de amplificação como controle positivo, originando um produto de 251bp. Para o controle negativo, foi adicionada 1,5μl de água miliQ.

4.6.6 Análise da presença do gene ragB nas amostras P. gingivalis positivas

Para determinar a presença do operon ragAB em amostras de P. gingivalis, foi realizada a amplificação através da utilização de pares de primers específicos, ragB2 (tabela 4.1) descritos por Hanley, Aduse-Opoku e Curtis (1999).

Para cada reação de amplificação foram utilizados 8,75μl de água miliQ; 2,5μl de solução tampão (10x PCR buffer); 0,5μl de solução estoque 10mM de cada dNTP (Invitrogen, São Paulo, Brasil); 0,75μl de MgCl2 cuja concentração foi otimizada para 1,5 mM; 0,25μl (100 pmol de cada Primer - 25 pM); 0,5μl de Taq Platinun DNA (Invitrogen, São Paulo, Brasil); 0,25μl de BSA (Biotools, New England, USA); e 3μl de DNA de cada amostra dos pacientes, totalizando de 16,75μl de reação.

As reações de amplificação foram realizadas com um ciclo inicial de 95oC por 1min. seguido por 30 ciclos de 95o_{C por 2 min., 50}o_{C por 1min, 72}o_{C por 2 min. e} extensão final a 72oC por 5 minutos (HANLEY; ADUSE-OPOKU; CURTIS, 1999).

Controles negativos e positivos foram incluídos em cada lote de amostras analisadas. O controle negativo foi constituído da mistura padrão de PCR com o

DNA molde trocado por 3μl de água estéril (miliQ); o controle positivo foi obtido utilizando-se a mistura padrão de PCR acrescido de 3μl de DNA molde da amostra de P.gingivalis W83, originando um produto de 436bp (HANLEY; ADUSE-OPOKU; CURTIS, 1999).

Todos os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5%, em tampão Tris Acetato EDTA (TAE - Tris acetato 40mM, pH 8,5; EDTA 2mM), corados com brometo de etídio, visualizados e documentados sob luz ultravioleta em transiluminador (Pharmacia Biotech, San Francisco, USA).