ANÁLISE MOLECULAR

De modo similar às análises morfológicas, análises moleculares foram realizadas tanto no Brasil quanto no Japão nos seguintes laboratórios:

► Laboratório de Genética Molecular de Plantas, Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em Natal, Rio Grande do Norte – Brasil, e;

► Laboratório de Micologia, Departamento de Botânica do National Museum of Nature and Science, em Tsukuba, Ibaraki – Japão.

Análises iniciais de extração do DNA genômico proveniente de materiais ocidentais, incluindo espécimes brasileiros, foram realizadas no Laboratório de Genética Molecular de Plantas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil. Nesta etapa foi utilizado o Whatman® FTA Classic Card (GE Healthcare Life Sciences), por se mostrar uma alternativa mais eficiente pela quantidade de material que seria utilizado, uma vez que geralmente espécimes antigos estão degradados e com pouco material disponível para extração. De cada amostra foi selecionado aleatoriamente um peridíolo, que ficou submerso em um tubo Eppendorf com 20µl de KOH 3% durante uma noite. No momento da coleta da amostra o peridíolo foi retirado com auxílio de ponteira esterilizada e colocado em uma das áreas circulares de coleta do FTA Card. Uma cobertura de Parafilm M® (Bemis NA) foi utilizada, individualmente por amostra, para evitar contaminação, sendo todo o material pressionado com a ajuda de um martelo. Um disco foi recortado com o auxílio de instrumento específico para o FTA Card, e o material foi transferido para um novo tubo de 1.5 ml, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. As amplificações foram realizadas com o auxílio de Ready-To-Go® PCR Beads (Amersham-Pharmacia Biotech), uma esfera provida de todos os reagentes necessários para uma reação de PCR, como buffer, nucleotídeos e Taq DNA polimerase, sendo necessária apenas a adição do DNA e dos primers a serem utilizados (Martín & Winka, 2000), em um volume final de 25µl, também seguindo o protocolo do fabricante.

Análises de materiais orientais e demais materiais ocidentais não possíveis de analisar no Brasil foram desenvolvidas na sala de DNA do Laboratório de Micologia do National Museum of Nature and Science, Japão. Peridíolos estocados em buffer DMSO foram macerados em nitrogênio líquido com auxílio de pistilo (Hosaka, 2009) e transferidos com o auxílio de espátulas limpas para novos tubos de 1.5 ml. Foi adicionado um buffer CTAB

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modificado (Hosaka & Castellano, 2008) e o material seguiu o protocolo de extração seguido do método de purificação por glass milk (Hosaka & Castellano, 2008; Hosaka, 2009). As amplificações foram realizadas com o auxílio de EmeraldAmp MAX PCR Master MIX (TaKaRa BIO Inc.), um líquido de cor verde e, similar ao PCR Beads, provido de todos os reagentes necessários para uma reação de PCR, como buffer, nucleotídeos e Taq DNA polimerase, sendo necessária apenas a adição do DNA e dos primers a serem utilizados, em um volume final de 10µl, também seguindo o protocolo do fabricante.

Para a amplificação foram utilizados os primers ITS1F (Gardes & Bruns, 1993) ou ITS1 (White et al., 1990), em combinação com ITS4 (White et al., 1990) para a região do Espaçador Transcrito Interno do DNA ribossômico (ITS 1 e ITS 2, incluindo o gene 5.8S), e LROR e LR5 (Vilgalys & Hester, 1990) para a região da Grande Subunidade do DNA ribossômico (nuc-LSU ou 28S). Para o procedimento foi utilizado um termociclador (TECHNE TC-512) com gradiente de temperatura ajustado de acordo com Martín & Winka (2000):

 ITS – Desnaturação inicial (94ºC – 5minutos); PCR em dois passos, sendo o primeiro de 5 ciclos (desnaturação [94ºC – 30 segundos], anelamento [54ºC – 30 segundos], extensão [72ºC – 1 minuto]) e o segundo de 33 ciclos (desnaturação [94ºC – 30 segundos], anelamento [48ºC – 30 segundos], extensão [72ºC – 1 minuto]); Extensão final (72ºC – 10 minutos); Armazenamento (4ºC - ∞);

 LSU – Desnaturação inicial (94ºC – 5 minutos); PCR em dois passos, sendo o primeiro de 5 ciclos (desnaturação [94ºC – 30 segundos], anelamento [54ºC – 30 segundos], extensão [72ºC – 1 minuto]) e o segundo de 33 ciclos (desnaturação [94ºC – 30 segundos], anelamento [48ºC – 30 segundos], extensão [72ºC – 1 minuto e 30 segundos]); Extensão final (72ºC – 10 minutos); Armazenamento (4ºC - ∞).

Devido a maioria das amostras serem antigas (em média coletadas no século XIX) e apresentarem o DNA em fragmentos, a amplificação completa da região ITS ou LSU do DNA ribossomal se tornou um desafio, tornando necessário o desenho de quatro novos primers (Fig. 6) – dois localizados internamente à região 5.8S, que é flanqueada pela região ITS 1 e ITS 2 do rDNA, e desenhados para servir de complemento aos conjuntos de primers externos já existentes, como ITS1/1F e ITS4 –; e dois localizados aproximadamente na porção central do LSU e desenhados para servir de complemento aos primers externos LR0R e LR5. Para o desenvolvimento desses novos primers foi realizado um alinhamento automático através do algoritmo Clustal W utilizando o MEGA – Molecular volutionary Genetics Analysis ver.

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7.0.14 (Kumar et al., 2016) com a maioria das sequências disponíveis no banco de dados online GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) para cada uma das regiões gênicas analisadas do gênero Cyathus (ITS e LSU do DNA ribossomal), utilizando sequências de Crucibulum laeve (Huds.) Kambly, Nidula niveotomentosa (Henn.) Lloyd e Cystoderma amianthinum (Scop.) Fayod como grupo externo. Todo o dataset consistiu de 31 sequências para ambas as regiões gênicas. Foram sondadas regiões com mais de 20 pares de bases contínuos e similares ao gênero em estudo e aos dois gêneros mais aparentados em Nidulariaceae, mas que diferissem da amostra de Cystoderma, e cercadas por regiões variáveis entre as amostras. Um número reduzido de substituições de bases entre as sequências foram permitidas, e o processo foi repetido tanto no início quanto na porção final das sequências a fim de obter primers para ambos os sentidos. Após a escolha da região de iniciação, foram realizadas anotações desta posição, e escolhida uma com o maior número de pares de base entre as sequências de

Cyathus e que apresentava menor número de gaps quando comparado com os outros membros

desse grupo. Em uma cópia do arquivo “FASTA” da espécie escolhida foram inseridos colchetes – [ ] – delimitando a região entre as primeiras 20 bases escolhidas, e as últimas 20 bases delimitadas como “similares” para o gênero em questão. A sequência foi utilizada no website PRIMER3 (bioinfo.ut.ee/primer3), designando a obtenção dos primers esquerdo e direito à sequência, e observando nos resultados do próprio website a inexistência de anelamento entre os próprios primers, se a temperatura de anelamento era equivalente entre os dois primers (uma vez que ambos serão usados com os mesmos parâmetros de PCR) e se a quantidade de Citosina e Guanina estava entre 40 – 60% da sequência.

Para a região ITS, os novos primers desenhados são:

 ITS-CyR3: localizado pouco após a região 5.8S em Nidulariaceae, é utilizado no sentido reverso, em conjunto com ITS1/ ITS1F/ ITS5.

ACCYAATAGAAGCRGYHCAA

 ITS-CyF4: localizado pouco antes da região 5.8S em Nidulariaceae, é utilizado no sentido direto, em conjunto com ITS4/ ITS4B.

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Figura 6. Mapa dos primers utilizados para amplificação dos produtos extraídos. Os primers CyR3 e ITS-CyF4 foram desenhados para a amplificação de parte da região ITS do rDNA, enquanto os primers LSU-CyR e LSU-CyF foram desenhados para a amplificação de parte da região LSU (28s) do rDNA. Os quatro primers foram testados apenas com o gênero Cyathus e em conjunto com os primers já conhecidos na literatura.

Para a região LSU, os novos primers desenhados são:

 LSU-CyR: posicionado próximo à porção central da região LSU do DNA ribossomal (quando comparado a sequências utilizando os primers LR0R – LR5), é utilizado no sentido reverso, em conjunto com o primer LR0R.

ATGCCAACATCCGAAGCAC

 LSU-CyF: localizado próximo à porção central da região LSU do DNA ribossomal (assim como o LSU-CyR), é utilizado no sentido direto, em conjunto com o primer LR5.

AAGGGAAACGCTGGAAGTCA

Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de Agarose 1% em buffer TBE 0.5x, utilizando marcadores de pares de base padrão (1 kb ladder) para confirmar o tamanho das bandas e 2µl de GelRed™ (Biotium) adicionado diretamente ao gel, para observação em Transiluminador UV (Cleaver Scientific). Os géis foram documentados por fotografia digital em equipamento específico acoplado ao transiluminador.

Para purificação dos produtos de PCR foi utilizado o reagente ExoSAP-IT® (USB), segundo instruções do fabricante. O sequenciamento dos materiais obtidos no Brasil foi realizado na Macrogen – Seoul, Coréia do Sul, utilizando os mesmos primers LR0R – LR5 e ITS1/1F – ITS4 que geraram as amplificações de PCR, enquanto que o sequenciamento dos materiais analisados no Japão foi realizado na sala de DNA do Laboratório de Micologia do National Museum of Nature and Science, Japão, através do BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc.) com os mesmos primers supracitados. A sequência consenso foi obtida através do programa DNA Baser Sequence Assembler v 4.23.0 (Heracle

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BioSoft, licença de demonstração) ou BioEdit ver. 7.2.5 (Ibis Biosciences), e foi utilizada a ferramenta on-line Standard Nucleotide BLAST (National Center for Biotechnology Information – Estados Unidos, disponível em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para confirmar se as sequências pertenciam realmente ao gênero Cyathus através de comparativos com os dados inseridos na plataforma on-line.

Sequências dos tipos e espécies identificadas por Zhao et al. (2008) e as geradas neste estudo foram alinhadas inicialmente com o algoritmo Clustal X e manualmente editados utilizando o MEGA – Molecular Evolutionary Genetics Analysis ver. 7.0.14 (Kumar et al., 2016). Foram desenvolvidos três grupos de dados (chamados aqui de dataset): um incluindo espécies que tiveram a região ITS sequenciada, um incluindo espécies com a região LSU sequenciada, e um dataset concatenado sem perda de dados, onde todos os taxa apresentaram tanto a região ITS quanto LSU do DNA ribossomal.

Análises de Máxima Parcimônia (MP) foram realizadas através do PAUP* ver. 4.0a150 (Swofford, 2002), com as árvores sendo calculadas através do método de Bootstrap com busca heurística. O algoritmo Tree Bisection Reconnection (TBR) e a opção Multrees foram aplicadas por default no PAUP*. O tratamento dos gaps foi testado como “fifth base” (quinta base) ou como “missing” (dado perdido) a fim de escolher a topologia mais acurada para a árvore (Ogden e Rosenberg, 2007). O número máximo de árvores foi limitado para 1000 e as árvores foram obtidas por análise de regressão por adição stepwise com 10.000 replicações e adições de sequências randômicas repetidas 10 vezes. A árvore consenso incluiu grupos compatíveis com 50% pelo consenso da regra da maioria (majority-rule consensus), excluindo grupos com proporções de Bootstrap menores ou iguais a 5%. Os níveis de homoplasia, índice de retenção, RI (Farris 1989), índice de consistência, CI, e índice de consistência reescalado, RC (Kluge & Farris, 1969) foram obtidos.

Análises Bayesianas foram realizadas utilizando o MrBayes ver. 3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003), com o melhor modelo de substituição escolhido pelo Mr.ModelTest ver. 2.2 (Nylander, 2004) para cada partição de dados (ITS e LSU). A análise usou duas corridas diferentes, com 4 simulações MCMC simultâneas em 10 milhões de gerações. As árvores foram amostradas a cada 1.000 gerações, descartando-se a porcentagem inicial como um estágio de burn-in para estimar a probabilidade posterior. O valor do burn-in, em porcentagem, foi obtido observando os valores do desvio padrão médio das frequências quando estes ficaram abaixo do valor de 0.01 durante as corridas do Mr. Bayes. O fator de redução da escala potencial (potential scale reduction factor – PSRF) foi observado para

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conhecer se os parâmetros dados pelo MrBayes se aproximariam de 1.0, indicando que as corridas convergiram (Gelman & Rubin, 1992). Os valores mínimos e médios referentes ao tamanho estimado da amostra (estimated sample size – ESS) também foram analisados. Valores de ESS abaixo de 100 podem indicar que os parâmetros de convergência foram subamostrados.

As árvores obtidas foram visualizadas no FigTree ver. 1.4.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/), exportada como PDF e editadas no INKSCAPE ver. 0.9.1 para Windows (https://inkscape.org/).

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