ANÁLISE PRELIMINAR DO FOSFOPROTEOMA NA INDUÇÃO DA EMT

4.7.1 Padronização da técnica ERLIC para enriquecimento de fosfopeptídeos

Com a finalidade de estudar a ativação das proteínas relacionadas com a EMT nos momentos iniciais do tratamento, foi feita a análise temporal do fosfoproteoma da indução da EMT sob a adição de TGF-β1 (10 ng/mL). Para isto, foi empregada a técnica de enriquecimento de fosfopeptídeos ERLIC adaptada para trabalhar em escala analítica para enriquecer amostras na escala dos miligramas. Para padronização, inicialmente foram enriquecidas 4 mg de extrato celular de PANC-1 sem tratamento e as frações obtidas no

sistema ERLIC foram analisadas em corridas rápidas por LC-MS/MS para identificar aquelas com maior número de fosfopeptídeos. Como pode se observar na Figura 38, da fração 2 até a 30 foram observados os fosfopeptídeos enriquecidos de nossa amostra, considerando que após a fração 26 a quantidade dos mesmos diminuía bastante. Entretanto, foi na fração 6 onde os fosfopeptídeos começavam a aparecer em maior abundância (Figura 44b), selecionando- se assim as frações 6 até a 26 para análise do fosfoproteoma.

FIGURA 38. Distribuição dos fosfopeptídeos após enriquecimento com ERLIC do extrato celular digerido de PANC-1

(A) Distribuição total dos fosfopeptídeos ao longo da corrida cromatográfica, todos as frações foram purificadas usando spin-tips RP-SPE C18 (B) Comparação da distribuição dos fosfopeptídeos frente aos peptídeos não fosforilados das frações 1 a 6, os fosfopeptídeos foram extraídos mediante troca iônica (SCX) usando HypersepTM _{spin-tips para evitar a perda de fosfopeptídeos devido a sua baixa}

abundância com respeito aos peptídeos não fosforilados. Foram digeridos aproximadamente 4mg de material. O tempo de corrida foi de 30 minutos. Os fosfopeptídeos identificados possuem um nível de confiança PhosphoRS ≥90%.

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4.7.2 Obtenção e análise dos dados do fosfoproteoma

A análise do fosfoproteoma resultante da indução da EMT sob o efeito do TGF-β1 foi realizada em triplicata, para dois pontos de tempo, 15 e 60 minutos. Conforme descrito na seção 3.13.1, a marcação isotópica SILAC-3plex permitiu essa comparação de controle vs. 2 tempos de tratamento em um único experimento. Para isto, as frações enriquecidas em fosfopeptídeos correspondentes a cada replicata (ver Tabela 4) foram analisadas por LC- MS/MS, sendo no total 63 corridas analisadas, dando um tempo de análise líquido de 82.5 horas, número estimado de espectros coletados (~10.000 por hora). Este imenso volume de dados resultou na identificação de 5.965 fosfopeptídeos não redundantes (4.384 fosfopeptídeos para a replicata 1, 2.040 para a replicata 2 e 2.768 para a replicata 3) correspondendo a um total de 2.250 fosfoproteínas analisadas. De todos os fosfopeptídeos observados, 2.053 foram quantificados ao menos em duas replicatas, aumentando a significância dos dados. Assim, no geral foram identificados 61 fosfopeptídeos regulados pertencentes a 55 fosfoproteínas (Figura 39). Como se observa, os peptídeos foram agrupados segundo o tempo de estimulação e organizados de forma descrente, usando como referência o log2 da razão tratamento (15 ou 60 min)/controle (T0). Caber ressaltar que certas proteínas tais como AHNAK e CTNND1 apresentaram mais de um fosfopeptídeo regulado (Figura 39).

Adicionalmente, foram realizadas análises de função molecular e processo biológico como descrito nos estudos anteriores (Tabela 26), observando-se que as alterações do fosfoproteoma estavam bastante relacionadas com processos de regulação do mRNA. Isto foi corroborado pela análise de interação de redes, usando STRING (Figura 40) onde se observam duas redes de proteínas, sendo a rede 1 enriquecida principalmente em funções relacionadas com metabolismo de ácidos nucleicos e o processamento do RNA, enquanto a rede 2 com uma variedade de funções relacionadas principalmente à localização de proteínas e à organização de organelas. Portanto, esta análise preliminar do fosfoproteoma também evidencia que mesmo nos momentos iniciais da indução da EMT, vias importantes relacionadas às funções da célula com características mesenquimais já estão ativadas.

FIGURA 39. Fosfopeptídeos regulados após a adição de TGF-B1 10 ng/mL por 15 e 60 minutos nas células PANC-1

Os * denotam os genes que apresentaram diferentes sequências de fosfopeptídeos alterados. A letra p minúsculo e em vermelho nos nomes das sequências denota o sítio de fosforilação na sequência. As cores vermelhas indicam redução da expressão, enquanto as verdes indicam aumento.

Dado que as fosforilações são modificações pós-traducionais dinâmicas que indicam possíveis ativações downstream a via de sinalização da proteína envolvida, uma busca das

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fosfoproteínas reguladas em nosso estudo frente à base de dados KEGG Pathway (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html) foi feita. Presilinin-1 (PSEN1) foi achada na via de sinalização do WNT (ko04310) relacionada diretamente com β-catenina cuja alteração e característica da EMT foram descritas anteriormente.CTNND1 (Catenin delta-1) relacionada com as junções aderentes (ko04520) especificamente interagindo com caderina, cuja regulação está intimamente ligada à EMT. EXOC4 (Exocyst complex component 4) relacionada com as junções celulares (ko04530). ACIN1 (Apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus) e SRRM1(Serine/arginine repetitive matrix protein 1) relacionadas com a via de vigilância de mRNA (ko03015) encarregada do controle de qualidade dos mRNA produzidos na célula. Porém, muitas das proteínas reguladas em nosso estudo não foram relacionadas com uma via de sinalização descrita nessa base de dados.

Análise de enriquecimento por função biológica e molecular do fosfoproteoma Função Biológica N° de genes % de genes p-valor corrigido (método de BH)

Regulação negativa da poliadenilação de mRNA 3 6,12 3,87E-03

Monoubiquitinação de histona 3 6,12 3,17E-03

Resposta celular ao estímulo do dano do DNA 7 14,29 2,93E-03 Processamento da forquilha de replicação 3 6,12 6,02E-03 Regulação positiva da ubiquitinação de histona H2B 2 4,08 1,06E-02 Regulação positiva do estabelecimento da localização celular

na membrana plasmática 3 6,12 1,24E-02

Ativação da atividade GTPase 3 6,12 1,21E-02

Ubiquitinação da histona H2B 2 4,08 1,81E-02

Regulação positiva da reciclagem de receptores 2 4,08 2,71E-02 Regulação positiva do splicing de mRNA, mediante

spliceosoma 2 4,08 2,66E-02 Função Molecular N° de genes % de genes p-valor corrigido (método de BH)

FIGURA 40. Rede de interação das proteínas reguladas no fosfoproteoma nos tempos 15 e 60 minutos após adição de TGF-β1