Os artigos publicados por diversos autores (Mao et al., 1997; Hyatt et al., 2002) especificam que se consegue distinguir em células infectadas com ranavírus um perfil de ~20 polipeptídeos entre 8 KDa e 120 KDa, por SDS-PAGE e após marcação das proteínas com metionina radiactiva. Nos resultados deste estudo, e visualizando apenas por coloração com azul brihante de Coomassie, observa-se um perfil de polipéptidos semelhante quer para células infectadas com os diferentes isolados virais, quer para as celulas Vero não infectadas. Não são perceptíveis diferenças, podendo-se concluir que o perfil de proteínas observado corresponde às proteínas das células Vero.
Esta experiência não foi elucidativa, e como não é possivel nas condições laboratoriais actuais a utilização de compostos radiactivos, optou-se por tentar distinguir as proteínas destes isolados virais, a partir apenas de vírus extracelular (virões).
Todos os isolados apresentaram padrões electroforéticos semelhantes, mas não idênticos, sendo a proteína viral mais abundante a que tem uma massa molecular de aproximadamente 50 KDa. Esta é a massa molecular da MCP dos Ranavirus conhecidos.
As diferenças observadas nos perfis de proteínas dos viriões dos diferentes isolados em estudo permite a sua distinção embora o elevado grau de semelhança corrobore os resultados obtidos com a análise dos genomas destes vírus. Pode-se ainda concluir que esta abordagem permite uma maior discriminação do que a sequenciação das regiões MCP e Pol.
Mafalda Dinis 42
VI. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS
Deste trabalho salientam-se as seguintes conclusões:
As condições de propagação e produção dos isolados virais em estudo foram optimizadas conseguindo-se a implementação de um meio independente de CO2 na replicação destes vírus. As cinéticas de replicação destes vírus, permitiram agrupar os vírus em estudo. Os vírus isolados
de tritões constituíram um grupo com cinéticas sobreponíveis, distintas das do FV3 e do vírus isolado de uma L. monticola, ambos com cinéticas também semelhantes.
De todos os métodos testados, a abordagem mais eficaz para distinguir os diferentes isolados, é análise das proteínas virais em que se obteve padrões electroforéticos semelhantes nas proteínas dos virões, mas não idênticos. O elevado grau de semelhança corrobora os resultados obtidos com a análise dos genomas destes vírus.
Os perfis de restrição com as enzimas HindII e BamHI não ficaram totalmente esclarecidos, sendo necessário a sua repetição em condições mais adequadas.
A sequenciação é a técnica considerada mais discriminatória e utilizada por diversos autores para a comparação e caracterização de novos isolados. Neste estudo não permitiu comprovar as diferenças observadas nos perfis de proteínas virais. Esta limitação deve-se a só se terem amplificado duas regiões altamente conservadas. Na continuação deste estudo será necessário utilizar primers dirigidos para regiões menos conservadas, ou idealmente sequenciar todo o genoma viral.
Foi possível identificar estes isolados como pertencentes ao género Ranavirus (sequência parcial das regiões MCP e Pol, metilação do DNA, CPE típico) e tudo indica a correspondência de todos à mesma espécie viral.
Os resultados dos Blasts efectuados indica que os vírus mais próximos são:
• CMTV e TFV (isolados a partir de anfíbios) e EHNV (isolado a partir de peixes), tendo em
consideração o gene Pol.
• BIV, RGV, RSV (isolados a partir de anfíbios) e STIV (isolado a partir de repteis), tendo em
consideração o gene MCP.
• Para o vírus geograficamente mais próximo (CMTV) obteve-se uma identidade 98% para ambas regiões estudadas, assim como para o FV3 e para o LMo.
Mafalda Dinis 43
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ANEXOS
Anexo A
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