Autores: OLIVEIRA, Leonardo G.; FERREIRA, Reginaldo N.; MAGNABOSCO, Claudio U.;
BORGES Clayton L.; PERON, Hugo J.M.C.; MOREIRA André; PÁDUA João T.
RESUMO – Foi avaliado o perfil protéico de animais de extremos valores de força de cisalhamento com sete dias de maturação da carne, extremo baixo (Macio) e extremo alto (Duro), da raça nelore mocho de uma população segregante para a maciez da carne. Proteínas relacionadas com a defesa celular com função anti apoptótica foram encontradas nos dois grupos de animais. Apenas identificada no grupo D, a proteína citocromo c indica indução do processo apoptótico. Proteínas estruturais foram identificadas no grupo M, indicando uma possível maior proteólise devido fato destas proteínas quando intactas não estarem solúveis no tampão de extração utilizado. Maior abundância relativa de proteínas do processo glicolítico foi evidenciado no grupo M e proteínas do metabolismo oxidativo foram evidenciadas mais expressas no grupo D, fato que provavelmente está correlacionado à maciez final da carne. A calpastatina foi somente identificada no grupo D, esta proteína está relacionada com a maciez final da carne por ser inibidora natural das calpaínas. A maciez da carne está relacionada a expressão de algumas proteínas ligadas ao estresse, ao tipo de metabolismo energético e a Calpastatina.
Palavras chave: Bos indicus; Força de cisalhamento; LC-MS; Metabolismo; Seleção genética.
ABSTRACT – Proteomic analysis was used to evaluate the protein profile of extreme WBSF values of 7 days aged meat animals, extreme low values (Tender) and extreme High (Tough), of Nellore owl breed from a segregating population of meat tenderness. Cell defense proteins related with apoptotic process were founded in both groups. Only identified in Tough group, the protein citochrome c indicates induction of apoptotic process. Structural proteins were identified in tender group indicating possibly more proteolysis due of these intact proteins are not soluble in this used buffer. Higher protein relative abundance of proteins related to glycolytic metabolic process as evidenced on tender group and proteins from oxidative process are more expressed in tough group, this fact is probably are correlated to final meat tenderness. Calpastatin was only founded present in tough group, and are related to final tenderness due to be a natural inhibitor of calpains. Final tenderness are related to the expression of some stress proteins, energy metabolism type and to the calpastatin.
Keywords: Bos Indicus; Genetic selection; LC-MS; Metabolism; Shear Force.
INTRODUÇÃO
Dentre os bovinos destinados à produção de carne no Brasil, a grande maioria é composta por animais da sub espécie Bos indicus, principalmente da raça Nelore, tendo como característica inportante a rusticidade comparados a animais Bos taurus, porém com carne com menor maciez (1).
A maciez da carne é uma das características organolépticas de grande importância e está relacionada diretamente à satisfação do consumidor (2,3) e é influenciada por vários fatores ante mortem e post mortem como a atividade de enzimas proteolíticas presentes no músculo, disponibilidade de energia pós mortem e velocidade de resfriamento da carcaça (4,5).
Diferenças consideráveis na maciez da carne podem ser explicadas pela herança genética e segundo (6) um programa de melhoramento genético com seleção para maciez é uma alternativa promissora para a produção de carne zebuína naturalmente macia. Trabalhos envolvendo o melhoramento genético de bovinos vêm sendo desenvolvidos visando selecionar indivíduos por suas características de interesse (7,8).
A expressão protéica nas células musculares destes animais pode apresentar diferenças devido às características herdadas dos seus genitores, influenciando todo o metabolismo celular e expressão das características fenotípicas. Para a investigação destes mecanismos metabólicos a análise proteômica se apresenta como uma ferramenta útil com grande aplicabilidade (9–11).
Este trabalho tem como propósito a caracterização das diferenças de expressão protéica do músculo Longissimus dorsi entre animais da raça Nelore Mocho de uma população segregante para maciez da carne.
MATERIAL E MÉTODOS Coleta e preparo das amostras
Um grupo de 83 animais contemporâneos, de uma mesma propriedade, oriundos de um programa de melhoramento genético da EMPRAPA denominado “Macro Programa 2”, fruto de acasalamentos com o propósito de selecionar animais com característica de carne macia, foram terminados em sistema de confinamento e abatidos quando atingiram peso médio de 510 kg de peso vivo. Estes animais foram abatidos em frigorífico inspecionado pelo sistema de inspeção federal (SIF) e sob condições humanitárias de abate. Uma amostra do músculo Longíssimus dorsi de cada animal foi coletada 30 minutos após a exanguinação, entre a 12ª e 13ª costela, na meia carcaça direita de 1,5cm de espessura abrangendo toda seção do músculo.
O tecido adiposo e conjuntivo visível de cada amostra foi retirado para após ser cortada em cubos de aproximadamente 1cm3, imergidas em nitrogênio líquido para congelamento e transporte até o Laboratório de Fisiologia da Digestão do Instituto de Ciências Biológicas II da Universidade Federal de Goiás. As amostras foram processadas em triturador com mini container (Waring® SN-04241-11) durante 3 minutos e armazenadas em freezer a -80ºC para posteriores análises.
Outra amostra com 2,54 cm de espessura foi retirada da meia carcaça direita dos respectivos animais 24 horas após o abate seguindo o mesmo protocolo. Estas amostras foram embaladas à vácuo e mantidas sob refrigeração durante 6 dias para a determinação da força de cisalhamento pelo método Warner-Bratzler Shear Force (WBSF) (12) no dia 7 post mortem.
Os animais foram ranqueados de acordo com os resultados da força de cisalhamento (WBSF) e foram selecionados para as analises os 10 animais dos extremos de alto WBSF (Grupo D) e baixo WBSF (Grupo M).
Extração proteica
A extração proteica e análise proteômica foram realizadas no laboratório de Biologia Molecular
“José Salum” – Instituto de Ciências Biológicas – Universidade Federal de Goiás. A fração solúvel das proteínas musculares foi extraída conforme (13). Cada amostra dos grupos baixo WBSF (Macio) e alto WBSF (Duro) foi solubilizadas em três vezes o volume de solução tampão fria de extração composto por 50mM de Tris, 1mM de EDTA com o pH ajustado para 8,5 com solução de HCl 6N em tubo, em equipamento BeadBeater (BioSpec, Bartlesville, USA) em tubos contendo 1/3 do volume da amostra em esferas de vidro ácido lavadas de 200–500 μm (Sigma Aldrich). Após a solubilização a amostra foi centrifugada por 20 minutos a uma temperatura de 4ºC a 40.000 x g. As proteínas solubilizadas na porção sobrenadante foram transferidas para outro tubo e quantificada a concentração de proteínas pelo método de Bradford et al. (14) em triplicata, utilizando curva padrão previamente construída com soroalbumina bovina. Três alíquotas foram feitas e armazenadas em freezer -80ºC.
Após a quantificação, foi procedida a eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida para verificação do perfil de bandas para confirmação da quantificação protéica. Para preparação de cada amostra, 20 µg de proteína foi colocado em tubo e 15 µL de tampão de amostra (TRIS/HCl pH 6,8 100mM, 4,0% de dodecil sulfato de sódio, 0,2% de azul de bromofenol; 20,0% de glicerol) e aquecido a 100ºC por 10 minutos. As amostras preparadas foram aplicadas em gel eletroforético de 12,5% de poliacrilamida com medidas de 10 x 10 cm (N,N’-bis-metileno acrilamida,1% de dodecil sulfato de sódio, 0,05% de N,N,N’-N tetrametiletiletilenodiamina (TEMED), 0,01% de persulfato de amônia;
0,5M de Tris com pH ajustado para 8.8 com uma solução de HCl) e corridas com voltagem constante de 120V. Após a corrida eletroforética os géis foram corados pela imersão durante 12 horas em solução azul brilhante de coomassie (1,7% de sulfato de amônio; 30% de metanol; 3% de ácido fosfórico; 0,1%
de Coomassie G-250). Os géis foram fotografados e estão apresentados no Anexo 1.
Análise proteômica
Uma alíquota de 200µg de proteína de cada animal do grupo D foi utilizada para compor uma amostra representativa do grupo e feito o mesmo procedimento com as amostras do grupo M para compor uma amostra representativa do grupo. A quantidade relativa a 200µg de proteínas foi retirada
de cada amostra representativa de cada grupo, lavadas com quatro volumes de água ultrapura utilizando filtros Amicon ultra 0,5mL (Merck Milipore, Darmstadt, Alemanha) de 3000 Da, em seguida com três volumes de solução aquosa de formiato de amônio 20mM. Após as amostras foram preparadas para a digestão de acordo com protocolo proposto por Borges et al. (11).
Para a digestão das amostras foram adicionados 2µg de Tripsina (Promega, Madison, WI, USA) diluída em solução de Bicarbonato de amônio (50mM de NH4HCO3) homogeneizada e incubada por 16 horas à 37ºC. Terminada a digestão, foram adicionados 40µL da solução aquosa de Ácido Trifluoroacético a 5%, homogeneizado e incubado a 37ºC por 90 minutos para a digestão do RapiGEST e após centrifugadas a 14000RPM a 4ºC por 30 minutos. O sobrenadante foi transferido para novo tubo e desidratado à temperatura ambiente em centrífuga Speed Vacuum (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) a 3000PRM durante 5 horas. As amostras foram resuspendidas com 120µL de solução aquosa de bicarbonato de amônio (50mM) e transferidas para frasco ultra limpo (Waters®, preslit PTFE/silicone caps). Para o ajuste do pH, 5µL da solução aquosa de formiato de amônio e em seguida 120 fempto Mol de enolase (Waters, Milford, MA, USA) como padrão interno. Em seguida a separação dos peptídeos digeridos foi procedida utilizando equipamento LC-MS 2D nano ACQUITY system (Waters, USA) equipado com duas colunas de fase reversa trabalhando em condição ácida e básica. A primeira coluna foi nanoEase BEH130 C18 (1.7 μm, 100 μm x 100 mm; Waters, USA) e a segunda coluna NanoAcquity UPLC BEH 130 C18 (1.7 μm, 100 μm × 100 mm; Waters, USA). Para a espectrometria de massas foi utilizado o Synapt G1 MS (Waters, USA) equipado com uma fonte de nanoeletrospray e dois analisadores de massas: um quadrupolo e um time-of-flight (TOF) operando em modo TOF-V. Os dados foram obtidos utilizando o equipamento em modo MSE em alternância de baixa energia (6 V) e alta energia (20-40 V) com modos de aquisição a cada 0,4 segundos.
Os dados obtidos usando o protocolo em modo MSE foram processados utilizando-se software ProteinLynx Global Server (PLGS) versão 2.4 (Waters, USA). Os dados foram submetidos a uma análise para a retirada de interferências, deisotopização e deconvolução de carga. O resultado foi comparado com banco de dados mundial de sequência de proteínas de Bos taurus UniProt (Universal Protein Source, http://www.uniprot.org/proteomes/UP000009136) para a identificação proteica.
Modificações como oxidação da metionina e serina e fosforilação da treonina e tirosina foram consideradas.
A comparação da abundância relativa das proteínas foi feita baseada na intensidade média da proteína padrão interno (enolase fúngica) e foi usada para converter a intensidade média dos peptídeos analisados para a quantificação absoluta da amostra injetada no equipamento. O software ExpressionE informatics v.2.5.2 foi utilizado para a comparação quantitativa. As proteínas identificadas foram organizadas pela expressão das proteínas do grupo M em relação ao grupo D e selecionadas as
proteínas induzidas ou suprimidas no mínimo de 50%. O modelo matemático utilizado para calcular as relações entre os grupos é parte do software PLGS (Wathers corporation, USA).
Determinação da atividade da enzima superóxido dismutase
Foi determinada a atividade da enzima superoxido dismutease nas amostras dos quatro animais dos extremos de cada grupo. As proteínas foram extraídas, dosada concentração protéica de cada amostra extraída e uma alíquota correspondente a 200 fempto Mol foi utilizada para a dosagem da atividade enzimática utilizado o Kit comercial SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), seguindo o protocolo descrito pelo fabricante.
Análise estatística
As médias dos valores de WBSF e de atividade da enzima Superóxido dismutase dos animais selecionados foram submetidas a analise de variância e (P<0,05) com o auxílio do pacote “easyanova”
do software R (R Core Team, 2013).
A comparação da abundância relativa das proteínas foi feita baseada na intensidade média da proteína padrão interno (enolase) e foi usado para converter a intensidade média dos peptídeos analisados para a quantificação absoluta da amostra injetada no equipamento. O software ExpressionE informatics v.2.5.2 foi utilizado para a comparação quantitativa. As proteínas identificadas foram organizadas pela expressão das proteínas do grupo M em relação ao grupo D e selecionadas as proteínas induzidas ou suprimidas no mínimo de 50%. O modelo matemático utilizado para calcular as relações entre os grupos é parte do software PLGS (Wathers corporation, USA).
A força de cisalhamento é a força necessária para cisalhar uma secção transversal de carne, em kg/cm2, e é uma medida direta na avaliação da maciez da carne (15).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Houve diferença entre as médias de força de cisalhamento entre os grupos de animais (Tabela 1).
7 Tabela 1 – Médias de força de cisalhamento transversal (WBSF) do músculo Longíssimos dorsi dos animais selecionados para compor o grupo macio (M) e grupo duro (D).
Grupos EPM# P valor*
Grupo D Grupo M WBSF*
(Kgf/cm2) 5,75 1,24 0,1254 <0,001
#Erro padrão da média
*Valor de probabilidade do teste F da análise de variância.
De acordo com a média de WBSF, a carne dos animais do grupo M pode ser considerada macia de acordo com Shackelford et al.(16), que definiram valores de WBSF abaixo de 4,5 Kgf.(cm2)-1 como carne macia. A maciez da carne vem sendo desenvolvido em animais da raça Nelore mocho e visa selecionar indivíduos que possuam superioridade genética para desempenho e carcaça. Este trabalho de seleção genética é importante, pois a maciez da carne é um importante atributo organoléptico (2,3) e de acordo com Castro et al. (8) esta seleção não afeta as características de deposição de gordura subcutânea, muscularidade e ganho de peso diário médio.
As proteínas são fruto da expressão dos genes do indivíduo e a diferença na produção das proteínas contribui para a diferença entre os indivíduos. As proteínas são responsáveis por diversas funções na célula muscular e podem estar solúveis no citoplasma da célula ou das organelas ou insolúveis, por exemplo, na estrutura celular ou membranas. Proteínas sarcoplasmáticas solúveis ligadas à defesa celular foram identificadas diferentemente expressas entre os grupos de animais (Tabela 2).
8 Tabela 2 – Proteínas relacionadas à defesa celular, diferentemente expressas entre os grupos macio (M) e duro (D).
Descrição Acesso# Score Relação
Macio:Duro* Função
14 3 3 protein epsilon 1433E_BOVIN 4312,4 1,82 Anti apoptose
14 3 3 protein gamma 1433G_BOVIN 3658,7 2,08 Anti apoptose
Mth938 domain containing protein AAMDC_BOVIN 4329,7 0,54 Anti-apoptose
Glutathione S transferase P GSTP1_BOVIN 24269,9 0,502 Detoxificação de radicais de oxigênio
Peroxiredoxin 1 PRDX1_BOVIN 20102,8 0,583 Detoxificação de radicais de oxigênio
Peroxiredoxin 2 PRDX2_BOVIN 13099,9 0,492 Detoxificação de radicais de oxigênio
Thioredoxin dependent peroxide reductase
mitochondrial PRDX3_BOVIN 1934,2 >100 Detoxificação de radicais de oxigênio
Peroxiredoxin 4 PRDX4_BOVIN 2045,8 0,560 Detoxificação de radicais de oxigênio
Superoxide dismutase Cu Zn SODC_BOVIN 5107,9 <0,01 Detoxificação de radicais de oxigênio S formylglutathione hydrolase ESTD_BOVIN 1914,5 0,502 Detoxificação por modificação Aldo keto reductase family 1 member B1 Q5E962_BOVIN 3095,3 >100 Metabolismo de açucar, glicosídeo,
poliol e carboxilato
Alpha crystallin B chain CRYAB_BOVIN 12623,7 2,203 Receptor transmembrana e sinalizador da via tirosina quinase
Tripartite motif containing 72 E1BE77_BOVIN 1316,0 >100 Reorganização do citoesqueleto dependente do ciclo celular
LIM domain binding 3 F1MRX5_BOVIN 1442,6 <0,01 Reorganização do citoesqueleto
dependente do ciclo celular
Protein CutA F1MTI7_BOVIN 2773,3 <0,01 Resposta a estimulos externos
Heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated
protein, 78kDa) F1N614_BOVIN 1138,0 <0,01 Resposta ao choque térmico
Zeta crystallin QOR_BOVIN 3608,2 0,492 Resposta ao choque térmico
Heat shock protein beta 6 HSPB6_BOVIN 18413,1 2,160 Resposta ao choque térmico
Heat shock protein beta 1 G3X7S2_BOVIN 27819,4 3,065 Resposta ao choque térmico Heat shock protein HSP 90 beta HS90B_BOVIN 484,5 >100 Resposta ao choque térmico Heat shock protein 75 kDa mitochondrial TRAP1_BOVIN 436,6 >100 Resposta ao choque térmico
Protein DJ 1 PARK7_BOVIN 47840,0 0,482 Resposta ao estresse oxidativo Aldehyde dehydrogenase 1 family, member L2 E1BDG9_BOVIN 164,7 <0,01 Transferidor de C-1
tetrahidrofolato-dependente
Aldehyde dehydrogenase E1BMG9_BOVIN 164,7 <0,01 Transferidor de grupos C-1 ativados
Serotransferrin G3X6N3_BOVIN 3555,5 >100 Transporte de íons metálicos (Cu, Fe, etc)
Cytochrome c CYC_BOVIN 3343,2 0,538 Transporte mitocondrial
# Número de acesso no banco de dados UNIPROT.
* Razão entre a abundância relativa da proteína no grupo M pelo grupo D.
A Heat shock 70kDa protein 5 (HSP-5 70) foi identificada inibida em animais do grupo M e a Zeta cristalin mais expressa nos animais do grupo D. As Heat shock protein 75 kDa mitochondrial e Heat shock protein 90 beta foram identificadas somente nos animais do grupo M e as Heat shock protein beta 1 e beta 6 e αβ-cristalin foram identificadas como mais expressas no grupo dos animais Macio.
As proteínas de choque térmico (HSPs) fazem parte de uma família de proteínas de uma cadeia interativa de chaperonas, constitutivamente expressas, tem rápida expressão sob condições de estresse com uma das principais funções a prevenção contra danos a célula (17). A família das HSP de 70 kDa está ligadas a proteção celular contra a apoptose promovendo a estruturação espacial correta das proteínas (folding) e prevenindo a translocação de proteínas pró apoptóticas por se ligarem a elas (17–19). A apoptose foi proposta recentemente como o primeiro estágio do processo de maturação da carne (20), contribuindo para o processo de amaciamento, favorecendo a ativação das caspases no processo apoptótico (18).
Outra forma de evitar danos à célula é evitando a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). Animais do grupo D apresentaram as proteínas Superoxide dismutase Cu Zn (SOD CuZn), Aldehyde dehydrogenase 1 (ADH1) e Peroxiredoxin 2 (PRX 2) identificada reprimida no grupo M.
Apesar de estar reprimida em animais do grupo M a atividade da SOD CuZn não apresentou diferença entre os grupos (Figura 1). A SOD é regulada por uma chaperona específica de Cobre para a sua ativação que introduz íons Cobre e pontes dissulfeto na sua molécula para torná-la ativa (21).
A PRX 2 foi relacionada com a característica maciez com 33% de repressão no dia 7 em relação ao dia 0 (22). A ADH1 também é um potencial para maciez, atua em processo citoprotetor e eliminando a conversão de aldeídos potencialmente citotóxicos gerados pela peroxidação lipídica e atuando também no processo glicolítico convertendo o gliceraldeído a 2-fosfoglicerato (23).
15Figura 1 – Atividade da enzima SOD (% inibição da formação do íon super óxido) entre os grupos baixo WBSF (Macio) e alto WBSF (Duro)
A proteína DJ1 foi identificada reprimida nos animais do grupo M e em conjunto com a proteína Mth938 domain containing e a PRX2 também está envolvida na defesa celular contra a formação de ERO e foram relacionadas negativamente com a maciez da carne durante juntamente com a SOD no processo de maturação (24). Os autores atribuíram os efeitos negativos à prevenção contra a apoptose e a não ativação das caspases no período post mortem, sendo estas proteases relatadas como importantes no processo de amaciamento da carne. A proteína DJ1 foi também encontrada menos expressa em animais com característica de carne mais macia provavelmente envolvida em algum processo que irá determinar a maciez da carne (25).
A proteína Cytochrome c foi encontrada como reprimida nos animais do grupo M, sendo possivelmente uma evidencia de maior ativação do processo apoptótico em animais do grupo D. Uma vez liberada no citoplasma, a proteína cytochrome c induz a formação do apoptossoma ativando o sistema das caspases, não corroborando com os achados descritos por Picard et al. (24).
Identificada induzida nos animais do grupo M, a proteína Heat shock protein 75 kDa mitochondrial está relacionada com a regulação negativa da apoptose inibindo a formação de ERO, a modulação da respiração celular, quando há falta de glicose disponível para evitar a formação de ERO (26). Esta proteína também foi apontada como possível marcador para maciez em estudo envolvendo o músculo Semitendinosus corroborando com o achado deste presente estudo (19).
A HSP 90 está envolvida em várias funções celulares e juntamente com a HSP 75 mitochondrial (TRAP1) desempenha função anti-apoptótica. Quando associada à óxivo nitroso sintase (ONS), a HSP 90 diminui a atividade proteólitica da µ-calpaína em 80% (27). A formação de uma tríade protéica na presença do íon Ca+ entre a HSP 90 a ONS e a µ-calpaína, afirmando que este sistema possivelmente constitui uma forma de regulação da µ-calpaína, possivelmente reduzindo a afinidade da pelo Ca+ atuando assim como inibidora parcial da sua atividade (28).
0 5 10 15 20 25
Atividade de SOD
Baixo WBSF Alto WBSF
Foram detectadas induzidas no grupo M a Thioredoxin dependent peroxide reductase mitochondrial (PRTDm) e a serotransferina, estas proteínas também estão ligadas à redução da atividade apoptótica pela redução de ERO (29).
A Proteina tripartite motif containing 72 (TMC72) se mostra identificada reprimida no grupo M, e pode ser uma possível contribuidora para o processo de amaciamento da carne. Está relacionada com o reparo da membrana celular e função anti apoptotica, se ligando com a fosfatidilserina e regulando proteínas de membrana cálcio dependente. Outra função importante é a ação negativa sobre o hormônio fator de crescimento semelhante à insulina, diminuindo a atividade de calpastatina e não restringindo a proteólise (30).
As proteínas Heat shock protein beta 1 (HSBb1), Heat shock protein beta 6 (HSPb6) e αβ cristalin (αβCST) foram evidenciadas induzidas no grupo M. Estas proteínas de menor peso molecular também fazem parte das chaperonas com a função de proteção da estrutura celular (31). A atividade destas chaperonas está envolvida na remodelagem da estrutura do citoesqueleto, se ligando a evitando a agregação e dificultando a ação de proteases, estabilizando e reorganizando as proteínas estruturais, com grande afinidade pela actina (32). Em estudo envolvendo o músculo Semitendinosus também foi evidenciado a proteína αβCST como um possível candidato a marcador para maciez (19).
Apesar de estarem altamente relacionadas com o processo de amaciamento da carne (33) o seu papel de proteção só é efetivo quando estão ligados à miofibrilas, não dissolvidos no sarcoplasma.
Após ocorrer o estresse da fibra muscular, estas chaperonas são rapidamente ativadas e se ligam às proteínas estruturais, ficando agregadas às miofibras (34), corroborando portanto com os resultados do presente trabalho. (18) encontraram que a supressão dos genes que codificam estas proteínas estão ligados com a característica de maciez da carne. Os autores afirmam que a supressão destas chaperonas leva a uma desorganização das proteínas estruturais presentes na linha Z do músculo facilitando assim a degradação.
O grupo das proteínas 14-3-3 foi identificado induzido em animais do grupo M e este grupo de proteínas desempenha as funções de inibição da apoptose e inibição da proteína kinase C. A Proteína kinase C tem a capacidade de fosforilar a calpastatina (CAST) , alterando as propriedades inibitórias desta, podendo desta forma atuar no processo de proteólise post mortem, regulando a atividade inibitória da CAST. A fosforilação da CAST favorece a agregação próximo ao núcleo da célula (35–
37).
Identificada reprimida no grupo M a S formilglutationa hidrolase (SFGH) tem função de detoxificação pela conversão do formaldeído em glutationa e formato auxiliando na proteção celular evitando danos à estrutura celular, corroborando com o presente estudo, favorecendo a ativação do processo apoptótico (38).
Única proteína estrutural reprimida no grupo M, a myosin light chain 1 3 skeletal muscle isoform (MCL1-3) (Tabela 3). Proteína ligada ao aparato contrátil do músculo esquelético, ligada a miosina de cadeia pesada e a actina, somente é encontrada na fração solúvel quando é hidrolisada ou quando alguma proteína em que ela está ligada é hidrolisada e está associada a proteólise post mortem inicial, na dissolução do rigor mortis (39). A liberação desta proteína pode estar provavelmente relacionada com a lesão celular pré abate e várias causas podem estar envolvidas como o estresse ocasionado no momento do abate. Eleita como provável marcador para maciez da carne, foi descrita por JIA et al. (25) como diferentemente expressa na fração solúvel em um curto período de tempo post mortem, resultado do início da proteólise.
9 Tabela 3 - Proteínas relacionadas a estrutura celular diferentemente expressas entre os grupos macio (M) e duro (D).
Descrição Acesso# Score Relação
Macio:Duro* Função
Cysteine and glycine rich protein 3 CSRP3_BOVIN 4295,65 <0,01 Citoesqueleto / proteína estrutural Myomesin (M-protein) 2, 165kDa E1BF23_BOVIN 832,84 >100 Citoesqueleto / proteína estrutural Myosin light chain 1 3 skeletal muscle isoform MYL1_BOVIN 6546,25 0,55 Citoesqueleto / proteína estrutural Adenylate kinase isoenzyme 5 KAD5_BOVIN 2139,97 >100 Conversão e regeneração de energia
Vinculin F1N789_BOVIN 705,96 >100 Guia da extensão longitudinal celular
Filamin B, beta E1BKX7_BOVIN 27,05 >100 Microtubulo/ citoesqueleto
Tubulin alpha-1C chain-like F1MNF8_BOVIN 130,93 >100 Microtubulo/ citoesqueleto Tubulin alpha 4A chain TBA4A_BOVIN 684,28 >100 Microtubulo/ citoesqueleto Kinectin 1 (kinesin receptor) F1MLU7_BOVIN 50,63 <0,01 Transporte tubulina dependente
Filamin A, alpha F1N169_BOVIN 6,69 >100 Transporte vesicular
# Número de acesso no banco de dados UNIPROT.
* Razão entre a abundância relativa da proteína no grupo M pelo grupo D.
Proteínas estruturais Filanin A alpha (αFILA), myomesin 2 (MYOM2), Tubulin alpha 4A chain (αTUB4A) e 1C (αTUB1A) da αtubulina e βfilanina B (βFILB) foram identificadas induzidas no grupo M. As proteínas estruturais encontradas solubilizadas logo após o abate, provavelmente são produtos da proteólise, pelo fato destas proteínas estarem associadas à fração miofibrilar insolúvel.
Estas proteínas são substratos para a µ-calpaína e para as caspases, e esta proteólise precoce pode estar associada ao turn-over protéico ou ao processo de apoptose (40–42). A proteólise libera peptídeos de menor peso molecular do que a molécula intacta e esses peptídeos (40,42,43).
Proteólise precoce da MYOM2 foi relatada por Anderson et al. (39) como uma proteína candidata a indicadora da maciez final da carne em bovinos corroborando com o presente estudo.
Além desta proteína a abundância da miosina de cadeia leve 1 na fração solúvel foi evidenciada sua rápida solubilização e teve alta correlação com a taxa de proteólise post mortem também sendo uma proteína de eleição como marcadora molecular de maciez da carne.
A proteína Kinectin 1 (KNT1) está suprimida no grupo M e está envolvida na estruturação da integrina e fibronectina no músculo estriado esquelético, proteínas estas presentes na estrutura da linha Z do sarcômero auxiliando no complexo de adesão e estabilização desta proteína (44).
Foi identificada reprimida no grupo M a enzima Alcohol dehydrogenase class 3 (ADH3) (Tabela 4). Esta enzima tem a função de converter álcoois a respectivos aldeídos e cetonas. O produto desta conversão poderá ser convertido à acetil-CoA e ser metabolizado no ciclo do ácido cítrico (45).
10 Tabela 4 - Proteínas relacionadas ao metabolismo de carboidratos, diferentemente expressas entre os grupos macio (M) e duro (D).
Descrição Acesso# Score Relação
Macio:Duro* Função
Aconitate hydratase mitochondrial ACON_BOVIN 6093,9 0,48 Ciclo do ácido tricarboxilico
Malate dehydrogenase cytoplasmic MDHC_BOVIN 39534,6 0,50 Ciclo do ácido tricarboxilico
Citrate synthase mitochondrial CISY_BOVIN 3519,9 0,52 Ciclo do ácido tricarboxilico
Malate dehydrogenase mitochondrial MDHM_BOVIN 41957,6 0,53 Ciclo do ácido tricarboxilico Dihydrolipoyllysine residue succinyltransferase
component of 2 oxoglutarate dehydrogenase complex m ODO2_BOVIN 1026,9 <0,01 Ciclo do ácido tricarboxilico
GLO1 protein (Lactoylglutathione lyase) A4FUZ1_BOVIN 7828,3 0,56 Composto-C e metabolismo de carboidratos O acetyl ADP ribose deacetylase MACROD1 MACD1_BOVIN 1193,6 <0,01 Composto-C e metabolismo de carboidratos Alcohol dehydrogenase class 3 ADHX_BOVIN 838,7 <0,01 Composto-C e metabolismo de carboidratos
Myoglobin MYG_BOVIN 92859,8 0,56 Distribuição e troca gasosa
Phosphoglycerate kinase 1 PGK1_BOVIN 145747,7 0,57 Glicólise e gliconeogênese
6 phosphofructokinase liver type K6PL_BOVIN 126,1 2,64 Glicólise e gliconeogênese
6 phosphofructokinase muscle type K6PF_BOVIN 1573,7 3,53 Glicólise e gliconeogênese
6 phosphofructokinase E1BCW3_BOVIN 209,7 >100 Glicólise e gliconeogênese
Creatine kinase B type KCRB_BOVIN 1489,2 47,47 Metabolismo da creatina
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase testis
specific G3PT_BOVIN 3685,5 0,43 Metabolismo de açucar, glicosídeo, poliol e
carboxilato
Mannosidase, alpha, class 2C, member 1 F1MWT0_BOVIN 725,2 >100 Metabolismo de açucar, glicosídeo, poliol e carboxilato
Glycogen starch synthase muscle GYS1_BOVIN 709,0 >100 Metabolismo de reserva de energia Phosphorylase kinase gamma 1 Muscle Q29RI2_BOVIN 813,4 >100 Metabolismo de reserva de energia ATP synthase subunit alpha F1MLB8_BOVIN 1187,4 0,30 Transporte de elétrons e proteína associada a
membrana
# Número de acesso no banco de dados UNIPROT.
* Razão entre a abundância relativa da proteína no grupo M pelo grupo D.
A enzima Dihydrolipoyllysine residue succinyltransferase component of 2 oxoglutarate dehydrogenase complex m (RDSODO2) , Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase testis specific (G3PT), Aconitate hydratase mitochondrial (ACONm), Citrate synthase mitochondrial (CSIm), Malate dehydrogenase mitochondrial (MDHm) e Malate dehydrogenase cytoplasmic (MDHc)foram identificadas suprimidas no grupo M e todas estas enzimas estão envolvidas no ciclo do ácido tricarboxílico. Os resultados sugerirem que os animais do grupo D apresentam metabolismo predominante oxidativo e outras proteínas interessantes encontradas suprimidas no grupo M são a Myoglobin e a ATP synthase subunit α (ATBSα), contribuem na caracterização de músculo dos animais do grupo D, com característica predominante oxidativa. Contrariamente a este resultado a ATBSα foi sugerida como uma eleita como possível marcador para a característica de maciez, mas contrariamente ao presente trabalho os autores utilizaram outro método de extração protéica que promove a solubilização de proteínas que o presente método utilizado (46). A presença desta proteína na fração solúvel pode estar ligada possivelmente à proteólise desta proteína.
Apesar de ser um atributo que é influenciado por várias características pré e pós abate, o tipo do metabolismo predominante na fibra muscular pode estar relacionado à característica de maciez onde fibras que predominam o metabolismo oxidativo estão relacionadas com carne mais dura (47,48). Mas são controversos os resultados encontrados na literatura que suportam estas características (49,50), atribuindo maior maciez a carne apresentando maior atividade oxidativa.
A supressão das proteínas Fatty acid binding protein heart, Prostaglandin F synthase 1, Prostaglandin reductase 2 e a proteína Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase nos animais do grupo M, ajuda a reforçar a característica oxidativa do músculo de animais do grupo D. A oxidação lipídica também pode ser uma característica de células que sofreram maior stress (18).
As enzimas envolvidas na glicólise 6 phosphofructokinase (6CPK), 6 phosphofructokinase muscle type (FKG1m) e 6 phosphofructokinase liver type (6CPKl) foram identificadas induzidas animais do grupo M. Este resultado reforça a idéia de que a característica de predominância de fibras glicolíticas está relacionada a maciez da carne. A característica de predominância do metabolismo glicolítico está relacionada com a presença de menores quantidades de calpastatina, maior fragilidade na constituição das proteínas que compõe a linha Z e maior pressão osmótica na célula muscular favorecendo o processo da proteólise post mortem (47).
Foi evidenciada a indução da proteína Creatine kinase B type, outra proteína que corrobora com a característica de células com predominância do metabolismo glicolítico. Fibras musculares com predominância do metabolismo glicolítico têm, em média, diâmetro maior quando comparada com
fibras com metabolismo oxidativo predominante, e esta característica está relacionada com a característica de maciez (51).
As proteínas Dihydropteridine reductase (DPR), Calpastatin (CAST), Cytosol aminopeptidase (APSc) e Peptidyl prolyl cis trans isomerase (PEP), Aspartate aminotransferase mitochondrial (ASTm) e citoplasmic (ASTc) peptidil prolil cis-trans isomerase (PPCTI) foram identificadas suprimidas no grupo M (Tabela 5).
11 Tabela 5 - Proteínas relacionadas ao metabolismo de proteínas, diferentemente expressas entre os grupos macio (M) e duro (D).
Descrição Acesso# Score Relação
Macio:Duro* Função
Aspartate aminotransferase cytoplasmic AATC_BOVIN 21150,8 0,57 Biosintese do glutamato Aspartate aminotransferase mitochondrial AATM_BOVIN 12146,2 0,42 Biosintese do glutamato
KBTBD10 protein A4FV78_BOVIN 2085,9 >100 Degradação proteica citoplasmática e nuclear
Adenosylhomocysteinase SAHH_BOVIN 2039,7 0,56 Degradação da homocisteina
Dihydropteridine reductase DHPR_BOVIN 2521,7 <0,01 Metabolismo da cisteina e grupo aromatico Transitional endoplasmic reticulum ATPase TERA_BOVIN 1595,0 >100 Modificação por ubiquitinação e deubiquitinação
Calpastatin G3N2N7_BOVIN 1011,0 <0,01 Degradação de proteinas e peptideos
Prolyl endopeptidase PPCE_BOVIN 563,0 <0,01 Degradação de proteinas e peptideos
Cytosol aminopeptidase G3N0I4_BOVIN 637,5 <0,01 Processamento proteolítico
Peptidyl prolyl cis trans isomerase FKBP1A FKB1A_BOVIN 2820,9 0,54 Tradução
nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2 F1MCM4_BOVIN 13,7 <0,01 Controle transcripcional Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase
Q2HJ26_BOVIN 2187,8 0,53 Anabolismo de
nucleotideo/nucleosideo/nucleobase LIM and cysteine rich domains protein 1 LMCD1_BOVIN 987,8 <0,01 Supressor transcripcional
# Número de acesso no banco de dados UNIPROT.
* Razão entre a abundância relativa da proteína no grupo M pelo grupo D.
Dentre os fatores que influenciam na maciez final da carne um dos principais fatores é a proteólise post mortem de proteínas estruturais das células musculares (43,52). O sistema proteolítico calpaína vem sido atribuído como principal no processo de proteólise post mortem (40,43,53–55) e a calpastatina está correlacionada negativamente com a maciez em bovinos por ser o inibidor natural das calpaínas (56–59).
A relação entre calpastatina/calpaína tem grande influência na taxa de proteólise post mortem e a presença de uma concentração maior deste inibidor irá contribuir negativamente para a proteólise (60).
Identificadas induzidas no grupo D as proteínas LIM domain binding 3 (DLIM3), Cysteine and glycine rich protein 3 (PRCG3) e LIM and cysteine rich domains protein 1 (PDRC1) fazem parte de uma família de proteínas regulatórias celulares mediando a interação protéica e o metabolismo de ácidos nucléico (61). Bernard et al. (18) utilizando a ferramenta transcriptômica, encontraram uma menor expressão desta proteína em animais com carne macia mas não encontraram associação direta com os mecanismos de amaciamento da carne.
Foram identificadas suprimidas no grupo M as proteínas nuclear receptor subfamily 5, group A, member 2 (FTN2), Sodium channel subunit beta 3 (CSβ3) (Tabela 6).possivelmente esta proteína pode ser negativamente associada a maciez atuando na estabilização destas proteínas estruturais, dificultando a proteólise post mortem.
12 Tabela 6 - Proteínas relacionadas ao metabolismo de lipídeos, ligadas ao transporte de íons, diferentemente expressas entre os grupos macio (M) e duro (D).
Descrição Acesso* Score Relação
Macio:Duro# Função
ATP binding cassette, subfamily A (ABC1), member 13 E1BM08_BOVIN 13.7 Duro Ligação de ATP
Calsequestrin Q05JF3_BOVIN 1811.5 >100 Ligante de Ca+
Retinal dehydrogenase 1 AL1A1_BOVIN 3922.9 0,51 Não calssificada
Alpha 1B glycoprotein A1BG_BOVIN 809.4 <0,01 Não calssificada
carboxymethylenebutenolidase homolog F1N2I5_BOVIN 1588.2 0,55 Não calssificada
Lumican LUM_BOVIN 958.9 >100 Não calssificada
Sodium channel subunit beta 3 SCN3B_BOVIN 545.3 <0,01 Transporte de cations (Na, K, CA, NH4, etc)
Nuclear transport factor 2 NTF2_BOVIN 3588.3 <0,01 Transporte nuclear
Hemopexin HEMO_BOVIN 1832.0 <0,01 Transporte de íons metálicos (Cu, Fe, etc)
Serotransferrin TRFE_BOVIN 7830.0 <0,01 Transporte de íons metálicos (Cu, Fe, etc)
Fatty acid binding protein heart FABPH_BOVIN 7743.3 0,42 Metabolismo de fosfolipídeos Prostaglandin F synthase 1 PGFS1_BOVIN 157.7 <0,01 Biosíntese de prostaglandinas Prostaglandin reductase 2 PTGR2_BOVIN 1846.0 <0,01 Biosíntese de prostaglandinas
# Número de acesso no banco de dados UNIPROT.
* Razão entre a abundância relativa da proteína no grupo M pelo grupo D.