Análise quantitativa e qualitativa dos constituintes de OEs

Neste trabalho experimental em que se pretendia caracterizar a composição dos OEs extraídos recorreu-se ao método analítico e cromatográfico mais adequado para a análise de compostos de natureza volátil: a cromatografia gasosa (GC). As análises de GC foram realizadas num cromatógrafo Perkin Elmer, Autosystem XL equipado com FID e coluna capilar em sílica fundida com 30 metros de comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno, sendo a fase estacionária do tipo DB-5 (5% fenil, dimetil polissiloxano). O hidrogénio foi utilizado como gás de arrastamento na coluna sob uma pressão aproximada de 12,5 Psi. As temperaturas do detector FID e do injector foram definidas para os 300º C e o injector de tipo

split/splitless apresentava uma repartição do fluxo na razão de 1:13. As análises

cromatográficas decorriam durante 90 min. seguindo o programa de temperatura crescente (3º C/minuto) com inicio aos 60º C e termino aos 285º C onde se mantinha constante por 15 min. Os volumes de OEs injectados variaram conforme as amostras, dependendo se se tratava de óleos obtidos a partir de material vegetal crescido

in vivo ou in vitro

(0,3-0,5 µl). Cada amostra foi injectada pelo menos três vezes nestas mesmas condições e com o apoio do programa Turbochrom da Perkin Elmer obtiveram-se réplicas dos relatórios analíticos onde cada pico estava associado a um tempo de retenção e a um valor da área do pico obtido por normalização.

A quantificação relativa passou pela determinação da percentagem real da área de cada pico (composto), obtida por uma cálculo de correcção da área total após subtracção das áreas correspondentes ao solvente, padrão interno (5a-colestano) e outros picos correspondentes a artefactos e ruído de fundo.

A quantificação absoluta foi realizada graças à adição de uma quantidade conhecida do padrão interno (5α-colestano) aquando da hidrodestilação ou posteriormente a esta quando se tratava de OE puro. Extrapolou-se a quantidade de cada composto por intermédio da razão entre as áreas dos picos dos compostos e a área respectiva ao 5-α-colestano tendo em conta também a sua concentração. Assim para cada uma das três ou mais réplicas de relatórios cromatográficos foi possível especificar o teor de cada constituinte, isto é, o teor relativo (%) e determinar, por aproximação, o teor absoluto

Material

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Métodos

69 expresso em µg/g de peso seco.Posteriormente o tratamento dos dados para cada amostra consistiu na determinação dos teores médios de cada composto e apresentação do respectivo erro associado, relativo à precisão do método cromatográfico em questão.

A identificação dos constituintes dos OEs foi efectuado com base em dados das respectivas análises por GC e por GC-MS. O cruzamento simultaneo dos dados recolhidos pela análise espectrométrica das amostras (espectros de massa obtidos para cada picos) e pela determinação dos Índices de Retenção de Kovats (KI) permitui chegar à identificação inequívoca da maior parte dos compostos. O cálculo do KI para determinado composto constitui um parâmetro importante para a sua identificação. Em muito casos foi possível confirmar a identificação dos compostos tendo por base a comparação dos respectivos KI com os publicados em artigos (para colunas com fases estacionárias equivalentes), de padrões conhecidos ou de misturas complexas já analisadas (Dob

et al., 2005;

Santos-Gomes e Fernandes-Ferreira, 2001). Este critério de identificação é bastante fiável e reprodutível num dado tipo de coluna e para uma dada série homóloga de compostos. Os KI foram determinados em relação a uma série homóloga de

n-alcanos co-injectados com as amostras de OE.

Este método constitui um dos métodos mais usados na identificação de compostos de OE (Shibamoto, 1987). Os índices de Kovats KI foram determinados em co-injecções efectuadas no GC e GC-MS, recorrendo à seguinte fórmula linearizada (Shibamoto, 1987):

Contudo, a determinação e utilização dos KI não é suficiente por si só para uma identificação inequívoca. Esta tem de ser coerente com a identificação espectral, baseada na comparação das semelhanças dos espectros de massa obtidos pelo GC-MS, com os espectros de massa de padrões e/ou espetros de massa de compostos inequivocamente identificados, armazenados nas bibliotecas anexas ao software do GC-MS ou publicados em literatura científica credível.

Assim, cada amostra foi analisada uma vez, injectando volumes de OE que variaram entre os 0,3 e os 0,5 µl num Cromatógrafo Gasoso Thermo Trace GC Ultra acoplado a um detector de massas Thermo-Finnigan Q de tipo

ion trap detector

(ITD). A coluna instalada no aparelho apresentava uma

Em que: t´R(x), t´R(n) e t´R(n+1) são os tempos de retenção ajustados entre a substância X e os alcanos anteriores e posteriores com n e n+1 carbonos, respectivamente.

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fase estacionária de características semelhantes à coluna do GC (coluna capilar em sílica fundida de 30 m de comprimento e 0,25 mm de diâmetro, com fase estacionária tipo TR-5, i.e., 5% fenil, dimetilo polissiloxano). As temperaturas do injector e da interface com a câmara de ionização foram de 300ºC e 250ºC, respectivamente. O Hélio (He) foi usado como gás de arrastamento sob um fluxo constante de 1,5 ml/min. A repartição de fluxo (split) na entrada da coluna foi equivalente a 1:13. O programa de temperatura aplicado foi exactamente igual ao definido no GC (60-285ºC com incremento de 3ºC/min). No interior da câmara de ionização (temperatura de 250ºC) as moléculas foram sujeitas a uma corrente iónica de 1600 mV para formar vários iões de fragmentação que após serem detectados pelo ITD seriam ordenados em espectros de massa característicos em função da razão massa/carga (m/z) e abundância relativa. Os espectros obtidos foram comparados com espectros de referência organizados em bibliotecas digitais por consulta destas através da base de dados NIST integrada no software do GC-MS, Excalibur 1.4.

Thermo Electron Corporation. Para um maior ajuste entre o espectro

do composto a analisar e os espectros propostos, utilizaram-se várias abordagens comparativas (identidade/semelhança e pesquisa directa/reversa) com mais do que uma biblioteca (TR, GP, Wiley, Mainlib).

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No documento Fragrâncias vegetais com actividade anti-insecto : óleos essenciais de Lavandula angustifolia P. Mill., Foeniculum vulgare Mill., Petroselinum crispum (Mil.) A.W. Hill e Anethum graveolens L. e suas actividades contra Anopheles atroparvus van Thiel, 1927 (páginas 87-90)