Análise de sobrevida dos RBPs

Subsequentemente, os RBPs elencados como extremos foram testados contra as amostras do TCGA. Dessa forma, é possível avaliar qual o impacto do nível de expressão das RBPs no prognóstico dos pacientes, sendo pelo aumento a resistência ao tratamento (mau prognóstico) ou por algum aspecto de proteção metabólico (bom prognóstico). Além disso, um importante ponto foi traçado nessa análise, o cálculo de sobrevivência foi executado de duas formas, i) utilizando as amostras combinadas de todos os tumores, com a finalidade de igualar a análise “pan-cancer” das linhagens celulares com as tumorais do TCGA; ii) em seguida, foi avaliada a contribuição individual de cada tumor em relação a sobrevivência e ao status do prognóstico.

A Figura 14 apresenta alguns casos de RBPs associados a bom prognóstico nas amostras dos tumores BRCA, COADREAD, BLCA, LUAD, HNSC, GBM, SKCM e LGG. A distribuição de expressão foi fragmenta em quatro partes idênticas (quartis) contemplando agrupamentos com expressão basal até superexpresso. Em detalhe, são ilustrados alguns casos para exemplificar a natureza exploratória da análise.

Figura 14. Análise de sobrevivência para RBPs em amostras do TCGA. Foram selecionados casos em que o status do prognóstico estivesse em acordo com o aumento da sensibilidade ou resistência à droga. A) A análise de sobrevivência de THOC1 e ANXA2 por tumor. B) Kaplan-meier derivados da estratégia “pan-cancer” para associação com sobrevivência, foram combinadas amostras dos tumores BRCA, COADREAD, BLCA, LUAD, HNSC, GBM, SKCM, LGG. Q1 = primeiro quartil de expressão, contemplando amostras com valores baixos de expressão, até 25% da distribuição; Q4 = quarto quartil de expressão, amostras em que a expressão do RBP está acima 75% da distribuição.

4. Discussão

A regulação da transcrição gênica é um mecanismo sofisticado que comanda desde a abundância dos transcritos até a composição da informação expressa. Além disso, recentes estudos têm discutido que a modulação da expressão gênica está envolvida na resposta a drogas em pacientes com câncer (KLIJN et al., 2015). Nesse contexto, os RBPs são apresentados entre as categorias gênicas capazes de influenciar essa dinâmica. No presente trabalho, foram desenvolvidas abordagens para análise de genes associados à transcrição e sua influência na resposta à droga.

Metodologicamente, a estratégia proposta reduziu a dimensão dos candidatos em dezenas de vezes, totalizando menos de 10% das correlações calculadas. Em adição, o método tem um caráter simples, sendo baseado na distribuição de correlações por genótipo e droga. Além disso, em comparação a outros métodos de priorização, a estratégia de outliers permite elencar diversos resultados (coletivamente), não um único caso por droga, como evidenciado na Figura 9. Tal aspecto, é valioso na discussão de múltiplos fatores conferindo resistência ou sensibilidade ao medicamento. Finalmente, a classificação em outliers permitiu não somente identificar os melhores candidatos por droga, mas também compará-los entre genótipos de TP53.

No nível da comparação funcional, é possível observar a distribuição de casos extremos de RBPs vinculados à resposta em diversas drogas. Em evidência, a droga anticâncer Refametinib, apresenta o maior número de casos em ambos os genótipos, 17 e 14 em TP53

Mutated e TP53 Wildtype, respectivamente. Curiosamente, alguns medicamentos parecem ter

características preferenciais por genótipo como, por exemplo, “Bryostatin 1” com 24 casos identificados apenas para o grupo TP53 Mutated. Em paralelo, quando avaliado globalmente o padrão das correlações, pode-se observar preferências entre os genótipos de TP53, ver Figuras 12-13. No total, 154 e 104 RBPs são apresentados por genótipo de TP53 Mutated e TP53

Wildtype, respectivamente. Entre os RBPs apresentados apenas 18% dos candidatos são

compartilhados entre os genótipos de TP53.

Em adição, são listadas no total de 73 e 23 drogas são particulares para os genótipos de TP53 mutado e selvagem, respectivamente. Em contrapartida, a distribuição de classes de drogas parece não estar enviesada por genótipo, observar legenda nas Figuras 12-13.

De forma absoluta, a quantidade de resultados envolvendo RBPs sugere uma forte influência desses genes em processos fisiológicos da célula e na resposta à droga. Em particular, quando comparados a outros genes vinculados à transcrição, o número de casos extremos de RBPs excede em dezenas de vezes categorias como, por exemplo, lncRNA. Além disso, com

exceção a categoria “protein coding”, RBPs são classe com maior número de casos enriquecidos por drogas, como é possível ver na Figura 11. O volume de casos vinculados aos RBPs pode estar associado às características funcionais desempenhadas por essa categoria gênica. Em detalhe, quando comparado a fatores de transcrição (TFs), os RBPs apresentam um espectro maior de funções, incluindo desde o nível transcricional (splicing e poliadenilação) até modificações pós-traducionais (PEREIRA; BILLAUD; ALMEIDA, 2017). Além disso, no que consta a comparação com protein coding, possivelmente, uma parcela significativa deve está vinculada a vias de metabólicas associadas aos alvos das drogas – explicando a maior quantidade de resultados para essa categoria gênica.

Por outro lado, outro aspecto interessante está relacionado ao padrão de mutualidade exclusiva entre os enriquecimentos, a maior das drogas está enriquecida para apenas uma categoria vinculada à transcrição. A droga Etoposide, por exemplo, está enriquecida apenas por RBPs extremos independentemente do genótipo de TP53. Em adição, outros casos exclusivos de RBPs são observados para as drogas IPA-3, Linsitinib, BAY-61-3606. Além disso, existem outros casos em que RBPs ou TFs são enriquecidos em conjunto a protein coding, o surgimento de tal fenômeno pode indicar a relação de “regulador-alvo” entre os candidatos na droga.

Em adição, outro aspecto interessante está vinculado à presença de único RBP em várias drogas. O gene NQO1 está posicionado como outlier extremo em 45 das 250 drogas (número não redundante), sendo dividido em 44 e 13 para cada genótipo TP53 Mutated e TP53 Wildtype, respectivamente. Em destaque, tem sido discutida a função de NQO1 como fator de proteção a drogas em câncer de mama (OH; PARK, 2015; YANG et al., 2014). Tal aspecto está consistente com os resultados identificados, sendo 55 casos que relacionam o aumento de expressão de NQO1 ao aumento dos valores de IC50 (resistência). Particularmente, a associação de NQO1 com várias drogas parece está sendo refletida nas curvas de sobrevivência da análise “pan- cancer”, considerando ambos os genótipos de TP53, ver Figura 14B.

Aliado a isso, RBPs como, por exemplo, ANXA2 tem sido associado a evasão da apoptose e resistência a várias drogas em neuroblastoma (WANG et al., 2017). Em adição, estudos tem vinculado ANXA2 a resistência medicamentosa em câncer de bexiga, tal aspecto é evidenciado na Figura 14. Além disso, ANXA2 está negativamente correlacionado com a droga Tubastatin A, a qual tem sido discutida como potencial terapêutico em câncer de bexiga (ROSIK et al., 2014; WAN et al., 2014). Dessa forma, a presença NQO1 e ANXA2 correlacionadas de forma negativa (resistência) em dezenas drogas, pode indicar um interessante aspecto para discussão de resistência a múltiplas drogas (do inglês, multidrug resistance – MDR).

Por outro lado, RBPs vinculados ao aumento de sensibilidade podem caracterizar outra vertente interessante, principalmente, durante a escolha medicamentosa e na definição da concentração da droga. Entre os casos classificados, o gene THOC1 pode ser realçado dada sua capacidade inibidor de vias proliferativas e de crescimento celular em alguns tumores. Em síntese, a superexpressão de THOC1 induz a parada do ciclo celular em tumores de pulmão, estacionando as células em G2/M, em seguida, promovendo apoptose (WAN et al., 2014).

Curiosamente, a assinatura de sobrevivência THOC1 foi encontrada apenas para amostras de câncer de mama, ver Figura 14A. Tal aspecto parece conflitante, uma vez que a droga associada a THOC1 é uma inibidora de ALK, denominada Alectinib, comumente administrada em pacientes com câncer pulmão (FAN et al., 2018). Por outro lado, algumas evidências têm sugerido um enorme potencial na utilização de ALK como alvo terapêutico em câncer de mama, bem como, a administração de drogas similares Alectinib (crizotinib) em subtipos tumorais de câncer de mama (GRANDE; BOLOS; ARRIOLA, 2011; PARSONS et al., 2017). Ademais, tem sido discutida a importância do genótipo de selvagem de TP53 para resposta a drogas quinases vinculadas ao receptor ALK em câncer (WANG et al., 2018). Tal aspecto corrobora com o achado de THOC1 associado à Alectinib apenas no grupo TP53

Wildtype. Em adição, a curva de sobrevivência apresentada na Figura 14A demonstra a relação

da superexpressão (curva azul) de THOC1 com o bom prognóstico em amostras de câncer mama. Dessa forma, embora preliminar tal achado pode servir para guiar ensaios funcionais em linhagens celulares de câncer de mama, a fim de compreender o possível mecanismo de interação de THOC1 com drogas inibidoras de ALK.

Finalmente, embora a análise de sobrevivência permita avaliar a eficácia das predições sobre resposta à droga, a interpretação de tais resultados ainda precisa ser avaliada cuidadosamente, sobretudo considerando a relação de especificidade das drogas por câncer. Além disso, em geral, algumas discordâncias entre o status da resposta à droga e ao prognóstico sugerido pela análise de sobrevivência [dado não apresentado].

Em conclusão, aqui foi apresentado uma abordagem para análise e prospecção de genes associados com a resposta a drogas. Além disso, foram discutidos aspectos funcionais das categorias gênicas, com ênfase nos RBPs, além de características globais como, por exemplo, a comparação do genótipo de TP53 com a dosagem das drogas em linhagens celulares. Finalmente, foi evidenciado o impacto da regulação dos RBPs na sobrevivência de pacientes nas amostras do TCGA.

6. CONCLUSÃO

Na pesquisa contra o câncer, a prospecção de alvos terapêuticos é imprescindível, principalmente, para desenvolvimento de novas estratégias associadas a prognóstico e tratamento do câncer. Na verdade, a busca por estratégias vinculadas ao tratamento e cura do câncer tem sido um alicerce para o desenvolvimento tecnológico das ciências da vida. Entretanto, embora seja uma questão fundamental, a compreensão de quais fatores são envolvidos com sucesso no tratamento ou mortalidade dos pacientes permaneceu por muito tempo desconhecido. Nesse contexto, a Bioinformática tem facilitado a avaliação de quais abordagens contribuem para o melhor prognóstico e a aumento da sobrevivência dos pacientes.

Em particular, a busca por antígenos e/ou marcadores tumorais são fatores importantes para aumentar a taxa de sucesso terapêutico, sendo principalmente empregados na construção de ferramentas de prognóstico, como subtipagem tumoral ou no entendimento de aspectos fenotípicos do câncer. Nesse contexto, o conjunto de proteínas de superfícies, o surfaceoma, tem papel fundamental no desenvolvimento de marcadores tumorais, bem como, na prospecção de novas drogas anticâncer (KUHLMANN et al., 2018). Por outro lado, o desenvolvimento de abordagens baseadas em imunoterapia tem sido discutido com outro potencial recurso no tratamento, principalmente, devido aos avanços obtidos na compreensão da imunologia do câncer. Recentemente, diversos trabalhos têm apontado a importância entre a associação de marcadores do resposta imunológica e a melhor significativa no prognóstico de pacientes com câncer (BARROS et al., 2018; PITCOVSKI et al., 2017). Além disso, alguns testes clínicos têm sido produzidos em busca de tratamentos que baseado em produtos do sistema imune como, por exemplo, as vacinas anticâncer derivadas de antígenos tumorais.

Por último, a dinâmica de resposta a drogas está inserida na discussão de medicina personalizada, sendo essa associada implicação direta na ineficácia do tratamento, mal prognóstico e recidiva tumoral (BORAN; IYENGAR, 2010). Nesse contexto, RNA-binding

Proteins, tem um papel de destaque na resposta ao tratamento, uma vez que sua desregulação

pode influenciar diversos aspectos da fisiologia celular (GLISOVIC et al., 2008). Além disso, estudos tem mostrado a associação de resposta ao tratamento com mecanismos pós- transcricionais e o genótipo de pacientes em câncer (LIU et al., 2016b; PELTZ et al., 2009). Dessa forma, a pesquisa sobre mecanismos de resposta à droga configura um aspecto adicional para aumentar a eficácia durante a escolha terapêutica.

Em conclusão, os achados apresentados nesse trabalho contribuem, de forma a complementar o avanço na compreensão de quais mecanismos são vinculados ao prognóstico

e a taxa de sobrevida dos pacientes. Além disso, os dados apresentados fornecem um substrato valioso para desenvolvimento de produtos biotecnológicos para o tratamento do câncer, bem como, para o avanço da medicina personalizada. Em parênteses, as assinaturas de antígenos tumorais em melanoma são um aspecto inovador para pesquisa clínica, as quais foram priorizadas e submetidas a processo de patenteamento. Finalmente, as abordagens desenvolvidas tem como resultado a produção de um acervo de informações, o qual correlaciona facetas da pesquisa contra o câncer em busca de novas estratégias para tratamento.

7. REFERÊNCIAS

1. AKULAPALLI, S. History of Cancer, Ancient and Modern Treatment Methods. J Cancer Sci Ther., v. 1, n. 2, p. 1–4, 2009.

2. ALLEMANI, C. et al. Global surveillance of trends in cancer survival 2000–14 (CONCORD-3): analysis of individual records for 37 513 025 patients diagnosed with one of 18 cancers from 322 population-based registries in 71 countries. The Lancet, v. 391, n. 10125, p. 1023–1075, 2018.

3. ANDROULLA, M. N.; LEFKOTHEA, P. C. CAR T-cell Therapy: A New Era in Cancer Immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. p. 5–18, 2018.

4. ARRUEBO, M. et al. Assessment of the evolution of cancer treatment therapies. Cancers, v. 3, n. 3, p. 3279–3330, 2011.

5. BABU, G. S. et al. Tumor markers : An overview. Journal of Orofacial Sciences. p. 87- 95 v. 4, n. 2, 2012.

6. BAILEY, M. H. et al. Comprehensive Characterization of Cancer Driver Genes and Mutations Article Comprehensive Characterization of Cancer Driver Genes and Mutations. Cell. p. 371–385, 2018.

7. BAILEY, P. et al. Exploiting the neoantigen landscape for immunotherapy of pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports, v. 6, n. October, p. 1–8, 2016.

8. BANSAL, A.; SINGH, M. P.; RAI, B. Human papillomavirus ‑ associated cancers : A growing global problem Biology of Human Papilloma. p. 84–89, 2016.

9. BARROS, L. et al. Immunological-based approaches for cancer therapy. Clinics (Sao Paulo, Brazil), v. 73, n. suppl 1, p. e429s, 2018.

10. BERTRAM, J. S. The molecular biology of cancer. Molecular Aspects of Medicine, v. 30, n. 2009, p. 29–41, 2011.

11. BLACKADAR, C. B. Historical review of the causes of cancer. World Journal of Clinical