Análise taxonômica e funcional

Após o controle de qualidade, foi feita uma análise taxonômica usando o LAST + RefSeq + MEGAN. Essa análise resultou num cluster ilustrado na Figura 22, com resultados dentro do esperado. Globalmente, formaram-se dois clusters principais – de metagenomas aquáticos e de metagenomas terrestres, em acordo com estudos anteriores sugerindo que o principal fator que influencia a microbiota é o substrato (Jeffries et al., 2011). Em um segundo nível, os metagenomas submetidos a condições bióticas e abióticas similares, como a luz solar, a temperatura, o fornecimento de oxigênio, o potencial osmótico e redox, o pH e o suprimento de nutrientes devem ter uma comunidade microbiana similar em seus ambientes (Elsas, van et al., 2006). Portanto, esses fatores podem determinar a formação dos clusters observados neste trabalho.

Na análise funcional realizada com o BioSurfDB, analisamos todos os genes disponíveis envolvidos nas vias de degradação de hidrocarbonetos juntamente com os genes da síntese de biossurfactantes (Cluster 1 na Figura 25 dos Resultados). Uma das principais

miscibilidade do biossurfactante em material hidrofóbico, a fim de assegurar sua biodisponibilidade para bactérias.

A temperatura é outro fator que afeta diretamente a biodegradação de hidrocarbonetos (Bossert et al., 1984; Davis e Gibbs, 1975). As baixas temperaturas são uma limitação importante para a biodegradação de hidrocarbonetos porque geram condições ambientais sub- ótimas para a biodegradação, como aumento da viscosidade, volatilização retardada de alcanos de cadeia curta (menos de 10 carbonos), insolubilidade de alcanos de cadeia longa, disponibilidade limitada de água e nutrientes; Especificamente, nitrogênio e extremos em pH e salinidade (Margesin, 2000). Em contraste, temperaturas mais elevadas aumentam as taxas de metabolismo de hidrocarbonetos para um máximo, tipicamente na faixa de 30 a 40 ° C (Bossert et al., 1984). Além disso, em áreas tropicais, há altas incidências de luz e altas temperaturas médias que favorecem organismos fotoautotróficos, como plantas, algas e cianobactérias, que podem sintetizar hidrocarbonetos lineares ou aromáticos (Pattanaik e Lindberg, 2015; Timmis et al., 2010; Winters et al., 1969). Portanto, a maior ocorrência de organismos degradantes e produtores de biossurfactantes em áreas tropicais, ver o cluster 1 na Figura 23, é provavelmente favorecido pela biodisponibilidade maior documentada de hidrocarbonetos nessas regiões quando comparada com regiões frias, ver o cluster 2 na Figura 23 (Desai e Banat, 1997; Leahy e Colwell, 1990; Ron e Rosenberg, 2001).

Outro resultado interessante foi a correlação entre a produção de surfactantes e biodegradação, ver Figura 26. A forte correlação (0,97) entre os genes de degradação e os genes envolvidos na biossíntese de biossurfactantes, observada neste estudo, reforça a necessidade de mais pesquisas sobre a distribuição biogeográfica tanto da degradação quanto dos genes de síntese de biossurfactantes, para aumentar nossa compreensão de sua ação integrada. No meio ambiente, esta evidência é uma importante contribuição para esse conhecimento, já que a maioria dos estudos biogeográficos existentes sobre degradação e

abundância de genes de surfactantes analisa essas vias separadamente (Beilen, Van et al., 2003; Bodour et al., 2003; Kurata et al., 2016).

Em relação aos testes de significância realizados com o STAMP, primeiramente foram comparadas as regiões tropicais com as não-tropicais (Figura 23). Streptomyces e Mycobacterium são o gênero mais representado em áreas tropicais (Cluster 1) e não-tropicais (Cluster 2), respectivamente. Ambos os géneros são descritos como capazes de degradar os hidrocarbonetos e produzir biossurfactantes (Desai e Banat, 1997). De fato, os microrganismos que degradam hidrocarbonetos são omnipresentes em vários ecossistemas, embora constituam menos de 0,1% da comunidade microbiana. No entanto, em ambientes poluídos pelo petróleo, eles podem representar até 100% dos microrganismos viáveis (Atlas, 1981). Portanto, quando analisamos a abundância desses genes em ambientes contaminados, não estamos apenas observando a dinâmica natural ou o aborto da comunidade bacteriana.

Neste estudo, Mycobacterium, incluído no filo de Actinobacteria, foi o gênero mais representativo em regiões não-tropicais (Cluster 2 na Figura 23). Da mesma forma, a primeira análise metagenômica de amostras de permafrost mostrou Actinobacteria como um filo dominante de acordo com a composição da comunidade relatada em outros solos polares (Barabás et al., 2001). A formação de biofilmes foi sugerida para otimizar a biodisponibilidade do substrato necessário para o crescimento de Mycobacterium sob baixas concentrações de antraceno (PAH) (Wick et al., 2002). No entanto, a produção de biossurfactantes não foi observada para Mycobacterium, o que pode explicar a baixa abundância de surfactantes em nossos resultados.

Seguidamente foram comparados os metagenomas terrestres com os aquáticos (Figura 24). Neste estudo, os gêneros Escherichia e Alcanivorax foram predominantes em metagenomas aquáticos, enquanto Streptomyces mostrou-se abundante em metagenomas terrestres. Escherichia pertence à família Enterobacteriaceae, pelo que não deverá mostrar

existência extracorpórea. No entanto, o sucesso de E. coli no ecossistema intestinal, um exemplo de um ambiente hostil, demonstra a sua capacidade para ocupar diferentes nichos ecológicos. Corroborando essa hipótese, estudos recentes que relatam o isolamento de E. coli indígena capaz de degradar o hidrocarboneto de solos contaminados (Ferradji et al., 2014; Yergeau et al., 2010) mostraram a propriedade de outra bactéria do gênero Escherichia, a E.

Fergusonii KLU01, isolada do solo contaminado com óleo, como degradador de

hidrocarbonetos, tolerante a metais pesados e um potente produtor de biossurfactante usando o óleo diesel como única fonte de carbono e energia (Shekhar et al., 2014). Da mesma forma, em (Sarma et al., 2004), foi isolada uma cepa entérica de Leclercia adecarboxylata PS4040 de amostras de solo, coletadas de um local contaminado com lodo oleoso que teve uma história de contaminação de mais de 100 anos, que geralmente é diferente de uma cepa clínica de L. adecarboxylata e mostrou que pode degradar outros PAH de dois e três benzenos (Sriram et al., 2011).

Nos metagenomas de água, o gênero hidrocarbonoclástico Alcanivorax é predominante quando comparado aos do solo. Apesar de ser predominantemente marinho e descrito como quase exclusivamente de degradação linear de alcanos e até 90% presente na água do mar contaminada com petróleo (Sarma et al., 2004), também foi encontrado em alguns ambientes salinos terrestres contaminados com hidrocarbonetos (Harayama et al., 1999). Os alcanos são hidrocarbonetos de cadeia aberta, que podem representar até 50% do petróleo bruto (Yakimov et al., 2007), e também podem ser sintetizados por cianobactérias (Rojo, 2009), sendo rapidamente degradados em ambientes marinhos (McGenity et al., 2012). Além disso, a análise funcional deste estudo mostra a predominância da via de degradação de alcanos lineares (degradação de ácidos graxos) em metagenomes de água e os genes de degradação predominantes de P450. Isso provavelmente deve-se à alta incidência do gênero Alcanivorax que possui um genoma altamente restrito de enzima catabólica, já que

este organismo usa hidrocarbonetos predominantemente alifáticos como fonte de carbono e energia e possui vários genes bem codificados para AlkB1 e AlkB2 e Citocromo P450 (Schneiker et al., 2006). Além disso, Alcanivorax e Streptomyces, são significativamente abundantes em aglomerados com uma prevalência de genes envolvidos na síntese de biossurfactantes e na degradação de hidrocarbonetos que também já foram relatados como produtores de biossurfactantes (Batista et al., 2006; Schneiker et al., 2006; Wang et al., 2010).

Além disso, outros estudos reportaram a predominância de genes de degradação de compostos aromáticos no solo (Liu et al., 2015) quando comparados aos genes de degradação de alcano AlkB. Observamos a predominância de genes de degradação aromática no solo quando comparados aos metagenomas da água. Isto é possivelmente justificado pelo fato de que os compostos aromáticos policíclicos são liberados para a atmosfera devido ao uso de combustíveis fósseis e são submetidos à degradação química e física. Consequentemente, os solos são o repositório primário de compostos aromáticos devido à sua capacidade de retenção de compostos hidrofóbicos (Wild e Jones, 1995). Streptomyces também são bactérias típicas do solo já descritas como capazes de utilizar PAH e petróleo como carbono e fontes de energia (Shekhar et al., 2014; Sriram et al., 2011). Estes resultados estão de acordo com isso, pois mostraram predominância significativa de Streptomyces nos metagenomes do solo.

4.3 Obtenção de consórcios microbianos através de petróleo da

camada pré-sal brasileira

Conclusões

Este trabalho esteve centrado na identificação de genes envolvidos em processos de biodegradação e produção de surfactantes.

Numa primeira fase foi realizada uma identificação in silico de todas as sequências proteicas e nucleotídicas, como de organismos, consórcios e metagenomas que estivessem associados a processos de biodegradação, biossurfactação e de biorremediação. A organização de uma quantidade significativa de informação genômica existente sobre estes domínios, permitiu criar o primeiro banco de dados especializado em biodegradação e biossurfactantes – o BioSurfDB. Por forma a tirar o maior partido do banco de dados, foram associadas várias ferramentas computacionais que permitem de forma fácil e integrada responder a muitas das principais questões colocadas pelos pesquisadores que desenvolvem atividade nestas áreas. Este sistema de informação, como um todo, foi publicado no final de 2015 numa revista especializada em bancos de dados e tem sido usado internacionalmente por vários grupos que desenvolvem pesquisa na área do petróleo, biorremediação, biossurfactantes e biodegradação. À data da publicação desta tese, este sistema de informação respondeu a cerca de 34 mil acessos, realizadas em mais de 74 geografias.

Face à constatação da falta de uma plataforma que agregasse grande parte da investigação que se realiza nas áreas da biodegradação, biossurfactação e de biorremediação e que faz uso de dados de genômica, foi criado o laboratório virtual Oil & Gas VRE. Esta plataforma vitual de apoio à investigação não tem como objectivo guardar directamente informação sobre organismos, genes, etc., mas sim recursos úteis como bancos de dados, ferramentas, protocolos e notícias, facilitando a sua partilha e discussão. Este sistema, foi

recentemente publicado numa revista de notícias da ERCIM (European Research Consortium

for Informatics and Mathematics).

Uma das etapas centrais deste trabalho consistiu na otimização de um conjunto de ferramentas computacionais existentes com vista ao tratamento de dados metagenômicos. Este trabalho foi bastante desafiante a nível computacional uma vez que foram tratados volumes significativos de dados de metagenómica provenientes de 70 amostras de solo e água obtidas em outros trabalhos científicos. A avaliação destas amostras heterogéneas na sua qualidade e nas suas características gerou resultados sobre a caracterização geográfica de vários grupos de genes associados a processos de biodegradação e produção de surfatantes. Foi possível provar a correlação entre as atividades de degradação de hidrocarbonetos e a produção de surfactantes, mostrando-se existir uma forte influência da latitude na diversidade destos genes associados a este tipo de processos. A informação obtida é muito relevante para a indústria, pela aplicação em estratégias de biorremediação.

Por forma a ser possível atingir o objetivo último deste trabalho, a identificação de genes envolvidos em processos de biodegradação e produção de surfactantes em amostras biológicas oriundas de poços petrolíferos, foram isolados consórcios bacterianos do petróleo da camada do pré-sal com capacidade de degradação de petróleo e produção de surfactantes. Este trabalho, ao contrário do trabalho descrito anteriormente, teve uma forte componente de bancada associada a uma componente bioinformática focada na avaliação de conjunto de dados de bibliotecas 16S. Este trabalho permitiu a obtenção de novas informações, com grande utilidade comercial, sobre a taxonomia e potencial biotecnológico da camada pré-sal brasileira.

Em suma, o presente trabalho permitiu alargar a fronteira do conhecimento no domínio dos surfactantes e biodegradação, principalmente no que toca ao impacto da bioinformática na resolução de questões biológicas das áreas de biodegração e produção de

surfatantes. A informação recolhida e organizada permitirá ajudar a pesquisa nestas áreas, pondendo levar ao desenvolvimento de aplicações de caráter tecnológico. De forma muito particular os consórcios produtores de surfactantes e degradadores de surfactantes estudados, podem vir a ser utilizados como ferramentas biotecnológicas pela indústria face as suas vantagens no que diz respeito aos impactos ambientais.

Em termos de trabalho futuro consideramos que devem ainda ser realizados mais alguns testes de validação laboratorial para a identificação precisa e validação dos consórcios com potencial para utilização em ferramentas biotecnolológicas com valor para a indústria. Será posteriormente muito pertinente a solidificação do pacote de software desenvolvido e a manutenção do novo sistema de informação por forma a que a comunidade cinetífica possa tirar o maior partido do trabalho desenvolvido.

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