A análise de viabilidade celular pelo ensaio de MTT mostrou que, diante dos diferentes tratamentos, a atividade metabólica mitocondrial das 3 linhagens celulares tumorais estudadas (SCC-9, SCC-15, SCC-25) foi afetada de forma distinta (Figura 7). Enquanto todos os tratamentos reduziram significativamente a viabilidade celular das linhagens SCC-15 e SCC- 25 em relação ao Controle, a linhagem SCC-9 apresentou redução da viabilidade celular somente nos grupos 5-Aza 0,3 e CDDP + 5-Aza 0,3 em relação ao grupo controle. Além disso, o grupo CDDP + 5-Aza 0,3 reduziu a viabilidade da SCC-9 quando comparado ao grupo CDDP.
Figura 7 – Gráficos representativos da viabilidade celular.***diferente do grupo Controle (p<0,0001); #diferente do grupo CDDP (p<0,05).
5.2 Análise de metilação do DNA
As figuras 8, 9 e 10 mostram os resultados obtidos pela análise de MS-HRM nas linhagens SCC-9, SCC-15 e SCC-25, respectivamente. O gene MGMT foi encontrado parcialmente metilado (50%) na linhagem tumoral SCC-9 (grupo Controle) e não se alterou após o tratamento com CDDP isolado. Porém, nos grupos tratados com 5-aza-2CdR, tanto os onde não houve associação quanto os associados com CDDP e em ambas concentrações, houve uma redução da metilação (Figura 8). O mesmo gene apresentou desmetilação em 100 % das células nas outras linhagens SCC-15 (Figura 9) e SCC-25 (Figura 10).
Figura 8 – Gráfico da análise de metilação SCC-9/MGMT pela técnica MS-HRM
Figura 9 – Gráfico da análise de metilação SCC-15/MGMT pela técnica MS-HRM
Figura 10 – Gráficos da análise de metilação SCC-25/MGMT pela técnica MS-HRM
O perfil de metilação das 3 linhagens em relação ao gene MGMT pode ser melhor visualizado na Figura 11.
Figura 11 – Mapa de calor do nível de metilação (SCC-9, SCC-15 e SCC-25)
5.3 Análise de expressão relativa
A figura 12 mostra os resultados de expressão relativa do gene MGMT para as linhagens SCC-9, SCC-15 e SCC-25. Na linhagem SCC-9, todos os grupos tratados, exceto CDDP, apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo Controle, sendo CDDP+5- Aza 0,3 o grupo que apresentou um aumento mais significativo da expressão do gene MGMT (4,81x, p<0,0003). Enquanto que, na linhagem SCC-25 foi observada uma redução da expressão do gene MGMT nos grupos tratados com 5-aza-2CdR, tanto os isolados (5-Aza 0,1 e
5-Aza 0,3, p<0,01), quanto os associados com CDDP (CDDP+5-Aza 0,1 e CDDP+5-Aza 0,3, p<0,0001) em relação ao Controle. Já na linhagem SCC-15 não foi encontrada diferença da expressão do gene MGMT.
6 DISCUSSÃO
O fato da língua possuir uma composição histológica incomum (rica rede linfática e estrutura altamente muscular) colabora para sua susceptibilidade à invasão metastática e recorrência de tumor (Lim et al., 2006) e, por sua vez, para prognósticos ruins, associados também a diagnósticos tardios (Archilla, 2018; Centelles et al., 2019) o que acarreta menor eficiência dos tratamentos para o carcinoma de células escamosas (Kelner et al.,2014; Liu et
al., 2016).
Entre os principais tratamentos utilizados estão a cirurgia, radioterapia ou a combinação entre radio e quimioterapia (Mao et al., 2004; Mazeron et al., 2009; Rapidis et al., 2009). No caso do uso de drogas quimioterápicas, a cisplatina é um radiossensibilizante efetivo, porém altamente citotóxico (Kwok et al., 2011).
A fim de estabelecer métodos alternativos de terapia, o nosso trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da associação de duas drogas já estabelecidas para tratamentos de câncer, o agente desmetilante 5-aza-2CdR e o quimioterápico CDDP, em 3 linhagens de carcinoma de células escamosas de língua, as quais possuem diferentes perfis em relação à idade de ocorrência, morfologia, atividade proliferativa e agressividade.
No presente estudo, foi observado que as linhagens estudadas responderam diferentemente aos tratamentos com relação a viabilidade celular (Figura 7). Enquanto que as linhagens celulares SCC-15 e SCC-25 tiveram sua viabilidade celular reduzida quando tratadas com o 5-aza-2CdR em ambas as concentrações testadas, 0.1 e 0.3 µM, a linhagem celular SCC- 9 só teve redução da viabilidade celular quando tratada com 5-aza-2CdR na concentração de 0.3 µM, mostrando que para a linhagem SCC-9, o 5-aza-2CdR foi dose-dependente. Além disso, em um estudo anterior do nosso grupo (Amaral et al., 2019), foi demonstrado que a concentração de 0.3 µM de 5-aza-2CdR não foi citotóxica para a linhagem SCC-9 nos tempos de 24 h e 48 h avaliados, mostrando que o 5-aza-2CdR age de maneira tempo-dependente em relação a viabilidade celular nessa linhagem, uma vez que no presente estudo o tempo de tratamento foi de 72 horas. Esses achados se sustentam, uma vez que, o uso de agentes desmetilantes em altas concentrações encontra-se associado a um efeito citotóxico imediato, como danos ao DNA, apoptose e parada do ciclo celular (Abele et al., 1987; Momparler et al., 1997), enquanto baixas concentrações se tornam mais específicas para as populações de células tumorais (Tsai et al., 2012).
As linhagens SCC-15 e SCC-25 mostraram-se mais sensíveis ao tratamento com CDDP a 0.1 µM, com redução da viabilidade celular, sugerindo que as células SCC-9 apresentam maior resistência ao tratamento com cisplatina nessa concentração quando comparada às outras linhagens. Estudos mostram que para a linhagem SCC-9 o valor encontrado de IC50 (4.79 µM) para tratamento com cisplatina, ou seja, a concentração que reduz em 50% a viabilidade celular, é maior do que para as outras linhagens (SCC-15 IC50 = 3 µM e SCC-25 IC50 = 2.41 µM) (Zhang et al., 2012; Kotowski et al., 2012; Elias et al., 2015).
Não houve potencialização de ação do CDDP quando associada à 5-aza-CdR, ou seja, o agente desmetilante não promoveu sensibilização das células à ação da cisplatina (Beyrouthy et al., 2009). Para o grupo CDDP + 5-Aza 0,1, a viabilidade diminuiu apenas nas SCC-15 e SCC-25, já com CDDP 0.1 µM +5-aza-2CdR 0.3 µM, todas as linhagens apresentaram uma redução de sua viabilidade, inclusive a SCC-9, que não se mostrou diferente apenas em relação ao controle, mas também em relação ao CDDP isolado.
Interessantemente, tem sido sugerido que mudanças epigenéticas em certos genes supressores de tumor poderiam predizer risco de recorrência tumoral (Goldenberg et al., 2004). Esses genes supressores de tumores estariam relacionados a processos de reparo do DNA, controle do ciclo celular, mecanismos pró-apoptóticos e regulação da diferenciação e proliferação celular (Esteller et al., 1999; Ha e Califano, 2006; Hema et al., 2017). O gene
MGMT (O6-metilguanina-DNA metiltransferase), um gene de reparo de DNA, localizado na banda cromossômica 10q26, é evolutivamente conservado, sendo regulado por múltiplos mecanismos, incluindo silenciamento epigenético por metilação no promotor, fato observado em média em 40% dos tumores do tipo glioma e câncer de cólon, e em 25% dos tumores de pulmão, linfoma e câncer de cabeça e pescoço (Esteller et al., 2000; Cabrini et al., 2015). O promotor do gene MGMT é visto frequentemente hipermetilado tanto mucosa oral circundante normal quanto no próprio carcinoma oral de células escamosas (Kato et al., 2006). No estudo publicado por Zuo e colaboradores (Zuo et al., 2004) em 94 casos de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, cerca de 18% apresentaram hipermetilação no promotor desse gene e 20% tinham perda de expressão.
Em nosso estudo, observamos que as células das linhagens analisadas apresentaram diferentes perfis de metilação e expressão do gene MGMT. Nas células SCC-9, o gene MGMT foi encontrado parcialmente metilado (metilação heterogênea) (Fig. 8), o que significa que 50 % das células estavam hipermetiladas na região analisada, como já descrito por Amaral et al. (2019) e devido a isso estava pouco expresso. No entanto, as células das linhagens SCC-15 e
SCC-25 foram vistas 100% desmetiladas na região analisada do gene MGMT (Figuras 9 e 10) e apresentaram maior expressão do gene MGMT em comparação com as células da linhagem SCC-9. Estudos jádemonstraram que a metilação do gene MGMT regula sua expressão (Rosas
et al., 2001; Kwong et al., 2002; Zuo et al., 2004; Qiao et al., 2018).
O uso clínico do agente desmetilante 5-aza-2CdR, o qual promove desmetilação por meio da inibição das enzimas DNA metilotransferases, está aprovado por agências de regulamentação como ANVISA no Brasil e FDA (Food and Drug Administratation) nos EUA (Palii et al., 2008; Seelan et al., 2018). Após tratamento por 72 horas com 5-aza-2CdR (0.1 e 0.3 µM), associado ou não a CDDP, observamos que a metilação do gene MGMT na linhagem SCC-9, ficou abaixo de 50 % (Figura 8) e isso resultou em um aumento da expressão do gene nessas células (Figura 12). Embora o tratamento isolado com 5-aza-2CdR na concentração de 0.3 µM tenha aumentado a expressão do gene MGMT nas células SCC-9, quando este foi associado a CDDP (CDDP + 5-Aza 0,3) esse aumento foi mais pronunciado, sugerindo que o CDDP pode ter potencializado a ação do 5-aza-2CdR uma vez que as células tratadas isoladamente com CDDP não apresentaram mudança da expressão de MGMT.
Embora as células das linhagens SCC-15 e SCC-25 possuam semelhança no perfil de metilação e expressão do gene MGMT, elas responderam diferentemente aos tratamentos com relação à expressão do gene. Enquanto as células da linhagem SCC-15 não apresentaram mudança na expressão de MGMT frente a nenhum dos tratamentos, as células da linhagem SCC-25 tiveram a expressão de MGMT diminuída após tratamento com 5-aza-2CdR (0.1 e 0.3 µM), tanto no tratamento não associado quanto no tratamento associado à CDDP. A diminuição da expressão não representa um efeito direto do 5-aza-2CdR sobre o perfil de metilação do gene
MGMT nas células SCC-15 e 25, uma vez que essas células não apresentavam metilação. No
entanto, é possível inferir que genes não-alvos desse estudo estão sendo afetados pela ação do 5-aza-2CdR e, possivelmente, alguns destes genes estão modulando a expressão de MGMT nessas células. Recentemente, Liu e colaboradores (Liu et al., 2018) mostraram que o gene
Trps1 (Síndrome trico-rino-falangeal 1) modula a expressão de MGMT em células de câncer de
pulmão resistentes à cisplatina.
Finalizando, observamos nesse estudo que independente da associação à cisplatina, as concentrações utilizadas de 5-aza-2CdR modificaram a expressão do gene MGMT nas linhagens de carcinoma espinocelular SCC-9 e SCC-25. Ainda, 5-aza-2CdR foi eficiente na desmetilação parcial do gene MGMT nas células SCC-9 o que promoveu o aumento de expressão deste gene nesta linhagem de células.
7 CONCLUSÃO
O tratamento com 5-aza-2CdR se mostrou dose-dependente na linhagem SCC-9. Porém, nas linhagens SCC-15 e 25 todos os tratamentos reduziram a viabilidade celular. Além disso os tratamentos associados não alteraram a viabilidade em relação aos tratamentos isolados, ou seja, não apresentaram resultados diferentes para nenhuma das linhagens. No entanto, as 3 linhagens estudadas apresentam diferentes perfis de metilação e expressão do gene
MGMT, sendo que o tratamento com 5-aza-2CdR aumentou a expressão de MGMT para SCC-
9 e, surpreendentemente, diminuiu na SCC-25. O CDDP potencializou o efeito da dose 0.3 uM de 5-aza-2CdR ao aumentar a expressão de MGMT na SCC-9.
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