Análises anatomopatológicas

Após avaliação funcional terminal, os animais ainda sob anestesia foram mortos com overdose de cloreto de potássio (KCl). Após a constatação da parada cardíaca, o coração foi retirado e então dissecado, para obtenção apenas do VE. Os VEs foram seccionados transversalmente, da base ao ápice, em secções de 5 mm (em média 8 secções – detalhes na Figura 5 do Apêndice

A) e as secções foram submetidas a diferentes métodos de coloração e processamentos para análises.

3.6.1. Avaliações Macroscópicas

As secções 1 e 4-7 foram coradas em uma solução de 1% cloreto 2,3,5- trifenil tetrazólio (TTC) em solução tampão de fosfato de pH 7,4. O procedimento foi realizado imediatamente após a retirada do coração. As secções transversais foram incubadas em 200mL da solução de TTC, sob agitação e a 37°C por vinte minutos. Após a coloração os cortes foram incubados em solução tamponada de formaldeído 10%, a temperatura ambiente por dez minutos. Os cortes foram lavados em água corrente e então fixados em solução tamponada de formaldeído 10%. A área de infarto foi então

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quantificada conforme detalhado no artigo publicado por Dariolli e

colaboradores (63) e no Apêndice A. Com o objetivo de obter o índice de

hipertrofia da parede de VE, a espessura da parede na lesão e na área remota foram medidas na secção média de VE (secção 4) em triplicatas. O índice de hipertrofia foi calculado por meio da razão entre a espessura da parede lesada e da parede remota. Todas as medidas macroscópicas foram obtidas a partir do software Image J® (66).

3.6.2. Avaliações Microscópicas

A secção 2 foi dividida em regiões: sadias, borda de infarto e infarto propriamente dito. Cada região foi congelada imediatamente em duplicatas, diretamente em nitrogênio liquido. A secção 3 foi dividida igualmente a secção 2 e as porções fixadas em paraformaldeído 4%. Após 48 horas da fixação, os tecidos foram dispostos em cassetes plásticos do tipo processador/inclusor. Os cassetes foram processados em aparelho autotécnico com ciclo total de 12 horas para a desidratação, diafanização e parafinização do material. Os tecidos

incluídos em parafina foram cortados em micrótomo (4m de espessura) e dispostos em lâminas.

A coloração de Picrossirius Red foi utilizada para medir colágeno intersticial bem como para a análise de microscopia de luz polarizada utilizadas para estimar a maturação do colágeno do tecido cicatricial. Para a avaliação de colágeno intersticial as lâminas, depois de coradas, foram digitalizadas e analisadas por meio de um software específico (Leica Imaging Systems). Este

software identifica e quantifica diferenças de tons previamente determinadas e

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Materiais e Método fotografias digitais no aumento de 20X do microscópio óptico foram tiradas de cada corte, estas foram escolhidas aleatoriamente sendo representante de todo o tecido cardíaco disposto na lâmina fotografada. Para correção dos erros de área em branco ou por erros de processamento, foram feitas medidas da área total de tecido em cada fotografia e estes valores foram utilizados para o cálculo final da diferença da área de colágeno encontrada em cada fotografia.

Por sua vez, a avaliação de maturação de colágeno por meio de imagens de luz polarizada foi realizada com auxilio de polarizador acoplado ao microscópio ligado a sistema de digitalização de imagem (Leica Imaging Systems). Quinze fotos randômicas da lesão foram registradas e analisadas no

software ImageQuant – Leica, para medir a porcentagem de fibras vermelhas,

amarelas e verdes que representam relativamente a porcentagem de fibras maduras (pouco flexíveis), intermediárias e imaturas (mais flexíveis), respectivamente. Para a análise das imagens o software foi ajustado para o parâmetro de cores HSI, onde cada uma das cores a serem enxergadas foi estabelecida com base em uma lâmina de um animal controle infartado e não tratado (animal não randomizado). Para as aquisições de vermelho foram usados os seguintes parâmetros: H: 16, 0; S: 255, 151 e I: 232, 12. Para as aquisições de amarelo: H: 34, 0; S: 210, 109; I: 253, 55. Para as aquisições de verde: H: 126, 13; S: 255,109 e I: 99, 9. A área total de tecido em cada imagem foi utilizada para normalizar a medida de porcentagem por área afetada.

A coloração usando Ácido Periódico de Schiff foi usada para quantificar o número de vasos nas três áreas de VE anteriormente descritas. Quinze imagens randômicas de 400X de magnificação foram registradas a partir de

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lâminas da região remota, da borda e IM. O número de vasos foi contado manualmente por dois operadores treinados e “cegos” para os grupos experimentais. O dado apresentado representa a relação entre o número de vasos por área de tecido avaliado.

As colorações com Hematoxilina e Eosina foram utilizadas para avaliar histologicamente o padrão das lesões e para avaliar se as células-tronco alogênicas injetadas geraram algum tipo de resposta imune celular de rejeição. As análises de rejeição foram feitas com base nas descrições prévias de

Malliaras e colaboradores (67). Em resumo, vinte fotos randômicas com 200X

de magnificação foram registradas de cada região de VE descritas anteriormente. As avaliações se basearam em observação de número, disposição e tipos celulares presentes em infiltrados inflamatórios encontrados nas fotos das três regiões de VE de cada animal, em cada um dos grupos experimentais. Para obtenção de padrão de análise foi utilizada a técnica de quantificação de rejeição estabelecida no ISHLT consensus (68), uma técnica consolidada para a avaliação de rejeição de órgãos transplantados. Todas as avaliações foram realizadas por dois observadores treinados e “cegos” para os grupos experimentais em questão.

3.6.3. Imunohistoquímica

Tanto para a avaliação e quantificação dos tipos de colágeno presentes na escara dos corações dos animais infartados dos diferentes grupos, quanto para a avaliação dos tipos de células inflamatórias observadas no VE, reações de imunohistoquímica foram realizadas conforme o protocolo abaixo.

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Materiais e Método Após o processamento do tecido, conforme descrito no item anterior, lâminas com os cortes de tecidos foram obtidas. Primeiramente os cortes foram desparafinados. Logo após a desparafinização foi realizada a recuperação antigênica por meio da reação de citrato de sódio em alta temperatura para a exposição dos epítopos. Uma solução de 3% de peróxido de hidrogênio (H2O2) foi utilizada por 10 minutos, para bloqueio da peroxidase endógena. Os cortes foram então bloqueados com solução 2% de BSA por uma hora a temperatura ambiente. Após lavagem, os cortes foram deixados incubando por 16 horas a 4°C com os anticorpos primários de interesse nas concentrações ideais para cada caso (detalhes na Tabela 1). No dia seguinte o material foi lavado e incubado por uma hora a temperatura ambiente com anticorpo secundário anti- IgG conjugado com biotina. Após o período de incubação, os cortes foram incubados por 30 minutos com estreptavidina ligada a HRP, seguidos de coloração por cinco minutos com diaminobenzidina (DAB - Zymed). O material foi então contra corado com hematoxilina e montado com lamínula. A análise da porcentagem de área corada foi realizada no software Leica QWin 3 (Leica QWin Plus V 3.5.1 – Leica Microsystems) em 10-15 imagens com 200X de magnificação.

Tabela 1: Anticorpos utilizados para realização das reações de imunohistoquímica:

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