Análises comportamentais

4.1.3.1 Teste do campo aberto

O teste do campo aberto foi utilizado para investigar a atividade locomotora e o comportamento exploratório dos animais (Figura 8A).

Os camundongos foram colocados individualmente no centro de um campo aberto de plástico circular azul (diâmetro = 44 cm, altura = 22 cm), com setores desenhados no chão. O número de cruzamentos (número de quadrados cruzados pelo animal com as quatro patas) foi utilizado para avaliar a atividade locomotora, e o número de levantadas (número de vezes que os animais se equilibram sobre as patas traseiras ou atividade exploratória vertical) para avaliar o comportamento exploratório. Os parâmetros foram registrados em um período de 6 min (Santos, Peres et al., 2012). O aparato foi higienizado com uma solução de etanol 10% entre os testes de cada animal, a fim de remover os odores ou pistas.

4.1.3.2 Teste do rotarod

O teste do rotarod foi utilizado para avaliar a integridade e coordenação motora dos animais. O aparato consistiu de uma barra giratória de 30 cm de comprimento e 3 cm de diâmentro subdividida em 4 compartimentos (Figura 8B). Para as análises no dia PN 30 foi realizado o protocolo de aceleração (Khariv, Pang et al., 2013), onde os animais eram colocados sobre a barra numa velocidade inicial de 5 rpm, a qual foi aumentando em média 1,25 rpm a cada 30 segundos durante 6 minutos, atingido uma velocidade final de 20 rpm. O tempo de latência para a primeira queda dos camundongos foi anotado.

Nos animais adultos foi realizado o protocolo com velocidade constante de 21 rpm durante 240 segundos (Colle, Santos et al., 2013). Antes do início da segunda exposição, os animais foram treinados, onde eles tiveram 10 tentativas para conseguir andar no rotarod por 1 minuto sem cair. Após a segunda exposição, os animais foram colocados para andar no rotarod e o tempo de latência para a primeira queda e o número de quedas foram utilizados para as análises estatísticas.

4.1.3.3 Teste do beam walking

O beam walking consistiu de uma viga de plástico de 100 cm de comprimento e 12 ou 6 mm de largura, posicionada a 50 cm do chão. Uma caixa contendo serragem foi colocada no final da viga para que os animais tivessem um incentivo para atravessar e chegar num local seguro (Figura 8C). Antes dos animais serem colocados na viga, eles eram deixados por 2 minutos nesta caixa para ambientação. Para as avaliações no PN 30, os camundongos foram habituados ao aparato (12 mm) 1 dia antes da realização do teste através de 5 provas, nas quais era

ensinado aos animais a tarefa de atravessar a viga sem parar até a caixa com serragem. Um intervalo de 2 minutos foi realizado entre cada prova para permitir o descanso dos animais. Para os animais adultos os treinos ocorreram antes da segunda exposição aos pesticidas na vida adulta, utilizando uma viga de 12 mm de largura. No dia do teste, os camundongos foram colocados na viga de 6 (camundongos jovens, PN30) ou 12 mm (camundongos adultos) de diâmentro inclinada levemente (15 graus) e o tempo para atravessar a viga, bem como o número de revaladas com as patas traseiras foram utilizados como medidas (Khariv, Pang et al., 2013). A média de três provas foi utilizada para análise estatística.

Figura 8: Desenho esquemático dos testes comportamentais. A) Campo aberto, B) rotarod, C) beam walking, D) pole test e D) single pellet. Fonte: (Brooks e Dunnett, 2009; Chen, Gilmore et al., 2014).

4.1.3.4 Pole test

O pole test é utilizado para medir a bradicinesia em modelos animais de DP (Park, Park et al., 2013; Aras, Tanriover et al., 2014). Para o teste foi utilizado um poste de ferro (50 cm de comprimento e 0,8 cm de diâmentro) revestido com esparadrapo para se obter uma superfície áspera, e fixado numa caixa contendo serragem para proteção contra eventuais quedas. Após o desmame, os animais foram previamente habituados onde foram colocados no topo do poste com a cabeça voltada para baixo e foi permitida a descida para a base do poste. Cada teste teve um tempo máximo de 60 segundos para o animal realizar a descida. Os animais que não aprendiam eram guiados até a base do poste. Foram realizadas 3 provas de habituação antes do teste. No dia do teste, os animais foram colocados no topo do poste com a cabeça voltada para cima e o tempo para virar a cabeça para baixo (início do movimento) e o tempo de latência para descer do poste até a base foram anotados. Foram realizadas 3 provas e a média dos tempos de cada prova foi utilizada como resultado (Aras, Tanriover et al., 2014). Na figura 8D, apresentada anteriormente, está representado um desenho esquemático do teste.

4.1.3.5 Teste do single pellet

Este teste consiste em uma tarefa de execução para avaliação da coordenação motora - começa com a olfação da pastilha de ração na parte frontal da câmara, seguido pelo movimento de levantamento da pata anterior, e ajuste postural para projetar a pata através de uma fenda estreita em direção à pastilha de comida até alcançar o alvo. Antes da realização do teste, os animais passaram por quatro dias prévios de treinamento e, para isto, eles foram submetidos a jejum de aproximadamente 20 horas antes de cada treino.

O teste foi realizado numa caixa de acrílico transparente medindo 19,5 cm de comprimento, 8 cm de largura e 20 cm de altura, com uma uma fenda vertical de 1 cm de largura e 15 cm de altura. Um suporte de 0,2 cm de espessura, 8 cm de comprimento e 2 cm de largura, situado a 1,1 cm do chão, na frente da câmara foi o local utilizado para apresentar uma pastilha de ração (o pellet) ao camundongo. Uma representação esquemática do aparato utilizado no teste está mostrada na figura 8E.

Para a realização do treinamento, as pastilhas de ração com cerca de 20 mg foram posicionadas no suporte, distante 1 cm da fenda e de forma central às extremidades. Os animais foram colocados na caixa com a cabeça voltada para o local onde era colocada a pastilha de ração devendo ele aprender à pega-la com a pata dianteira. Os animais foram treinados individualmente durante 10 minutos. Durante o treino, cada animal deveria pegar dez pastilhas de ração, de modo que se o animal conseguisse agarrar a ração através da fenda, sem deixar que a mesma caísse no chão, a tentativa era considerada como sucesso (“S”). No entanto, se o animal batesse na pastilha de ração sem pegá-la ou a deixasse cair após pegá-la, a tentativa era considerada como fracasso (“F”). Todos os treinos foram realizados nos animais adultos antes de iniciar o protocolo da segunda exposição. Os animais que não aprenderam a tarefa foram descartados do teste final (3 animais machos e 1 fêmea do grupo salina + salina; 4 machos e 2 fêmeas do grupo salina + (PQ+MB); 1 macho do grupo (PQ+MB) + salina; 1 macho e 1 fêmea do grupo (PQ+MB) + (PQ+MB); 6 machos e 1 fêmea do grupo LPS + salina; 2 fêmeas do grupo LPS + (PQ+MB)). No dia do teste foi anotado o número de sucessos e fracassos para apanhar a pastilha de ração num total de 10 tentativas no tempo máximo de 10 minutos. Os dados foram representados como porcentagem de sucessos: % Sucessos = S/(S+F) x 100. Este teste foi realizado somente nos animais adultos como descrito previamente (Chen, Gilmore et al., 2014; Schmitz, De Oliveira et al., 2014).