Análises cromatográficas

3.3.2.1. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Todas as amostras analisadas, solubilizadas em metanol, foram aplicadas com auxílio de capilar em placas pré-confeccionadas de gel de sílica 60F254 (Macherey-Nagel®). O eluente utilizado foi acetato de

etila:acetona:ácido acético: água (8:2:1:1, v/v/v/v). As placas foram reveladas com reagente natural A (difenilboriloxietilamina 1% em metanol), o qual quando observado sob luz UV 365 nm confere fluorescência aos flavonoides. Após a visualização dos flavonoides, as mesmas placas foram borrifadas com anisaldeído sulfúrico e aquecidas, para revelar compostos com características de saponinas e também de açúcares.

Além da análise de flavonoides, saponinas e açucares, foi avaliada a presença de aminoácidos. Como fase fixa foi empregado gel de sílica 60F254 (placas Macherey-Nagel®) e a fase móvel foi

butanol:ácido acético:água (12:3:5, v/v/v). O reagente cromogênico empregado na revelação das cromatoplacas foi ninhidrina.

3.3.2.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

3.3.2.2.1. Análise dos flavonoides

As análises por CLAE foram realizadas à temperatura ambiente (21 ± 2°C) em um equipamento Perkin Elmer® _{200 equipado com}

detecção de arranjo de diodos (DAD – 200 a 400 nm), bomba quaternária, degasser on-line e injetor automático. Como fase fixa foi utilizada a coluna analítica Perkin Elmer® _{Brownlee C}

18 com diâmetro

interno de 250 x 4,6 mm e tamanho de partícula de 5 µm. O volume de injeção foi de 20 µl de cada amostra previamente solubilizada em metanol:água (1:1, v/v). A concentração das frações obtidas do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis foi de 1 mg/ml. O fluxo foi de 1,2 ml/min, utilizando um gradiente linear de acetonitrila (solvente A) e ácido fórmico 0,5% em água (solvente B). O gradiente empregado foi: 0 - 15 min, 15% - 35% A, sendo a fase móvel preparada diariamente e desgaseificada a vácuo por ultrassom (10 min) previamente ao uso. Os cromatogramas foram monitorados a 340 e 205 nm para visualização dos flavonoides e das saponinas, respectivamente e os dados obtidos foram processados no software Chromera® _{(Versão 3.2.0.4847). Os}

padrões utilizados foram os flavonoides glicosilados: 6,8-di-C-glicosil- crisina, isoorientina, isovitexina, vitexina-2”-O-xilosídeo, swertisina e vitexina-2”-O-ramnosídeo.

3.3.2.2.2. Análise das saponinas

As análises por CLAE foram realizadas à temperatura ambiente (21 ± 2°C) em um equipamento PerkinElmer® _{200 equipado com}

detecção de arranjo de diodos (DAD – 200 a 400 nm), bomba quaternária, degasser on-line e injetor automático. Como fase fixa foi utilizada a coluna analítica Phenomenex® _{fenila Bondclone 10 (300 X}

3,9 mm; 10 µm). O volume de injeção foi de 20 µl de cada amostra previamente solubilizada em metanol:água (1:1, v/v). O fluxo foi de 1,2 ml/min, utilizando como eluente misturas de acetonitrila (solvente A) e água (solvente B). O sistema empregado foi: 0 - 10 min, isocrático 20% A; 10 – 30 min, gradiente linear 20% - 35% A; e 30 – 40 min, isocrático 35% A; sendo a fase móvel preparada diariamente e desgaseificada a

vácuo por ultrassom (10 min) previamente ao uso. Os cromatogramas foram monitorados a 340 e 205 nm para detecção dos flavonoides e das saponinas, respectivamente e os dados obtidos foram processados no

software Chromera® _{(Versão 3.2.0.4847).}

3.3.3. Fracionamento bioguiado do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis

3.3.3.1. Obtenção das frações enriquecidas em aminoácidos, flavonoides e saponinas

Tendo em vista a presença de aminoácidos, flavonoides e saponinas, o extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis foi processado visando a separação desses componentes conforme mostrado esquematicamente na figura 3.5 e descrito abaixo.

Figura 3.5: Esquema representativo do fracionamento do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis para obtenção das frações enriquecidas nos metabólitos majoritários do extrato.

3.3.3.1.1. Separação da fração enriquecida em aminoácidos

O extrato foi submetido a uma coluna cromatográfica de troca iônica fortemente catiônica Amberlite® _{IR120. Para isso, a resina}

Amberlite® _{IR120 (40g) foi acondicionada em uma coluna de vidro e}

ativada com aproximadamente 150 ml de ácido clorídrico 1N. Posteriormente, a resina foi lavada com água destilada até neutralização e uma solução do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis (1g de extrato em 20 ml de água destilada) foi aplicada na coluna. Depois a solução foi reaplicada na coluna por mais duas vezes para aumentar a ligação dos aminoácidos presentes no extrato à resina acondicionada na coluna. Após, a coluna foi lavada com 300 ml de água destilada para retirar os compostos não aderidos à resina. Assim, ao final desse procedimento obteve-se uma solução do extrato “livre” de aminoácidos. A coluna cromatográfica foi então eluída com 500 ml de hidróxido de amônia 3N para reverter ligações químicas formadas entre a resina e os aminoácidos existentes no extrato e posteriormente foi lavada com água destilada até pH neutro e acondicionada com mistura de metanol:água (70:30, v/v). Ao final da coluna obteve-se uma solução aquosa do extrato “livre” de aminoácidos e uma solução amoniacal contendo grande parte dos aminoácidos presentes no extrato, as quais após serem secas em evaporador rotatório forneceram a fração “livre” de aminoácidos e a fração enriquecida em aminoácidos do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis, respectivamente.

3.3.3.1.2. Separação das frações enriquecidas em saponinas e flavonoides

A fração “livre” de aminoácidos (150 mg) foi solubilizada em metanol e essa solução foi aplicada em uma coluna de Sephadex® _LH-

20 (40 g), a qual foi eluída com metanol. Sabendo-se que a separação dos compostos químicos deve-se ao peso molecular dos mesmos, foram obtidas inicialmente frações contendo majoritariamente saponinas e posteriormente frações contendo majoritariamente flavonoides. Após o agrupamento das frações e a secagem em evaporador rotatório obteve-se a fração enriquecida em saponinas e a fração enriquecida em flavonoides.

3.3.3.2. Obtenção do flavonoide majoritário do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis – vitexina-2”-O-xilosídeo O isolamento do flavonoide majoritário do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis, vitexina-2-O-xilosídeo foi realizada pelo doutor Geison Modesti Costa (Programa de Pós-graduação em Farmácia-UFSC) durante seu estágio doutoral na Universidad Nacional

de Colombia, Bogotá, Colômbia conforme descrito em sua tese (COSTA, 2013).

3.3.4. Obtenção do flavonoide majoritário do extrato aquoso