Como dois clados bem suportados foram detectados (Figura 19), aplicou-se uma abordagem Bayesiana usando o software Densitree com o intuito de verificar as melhores topologias com base nas densidades das árvores armazenadas (10,000 árvores) provenientes das análises do BEAST. Nesta análise, os ramos com as cores mais intensas e mais densas são assumidas como as topologias mais prováveis das árvores. Com base nesta análise, observou-se que uma variante do IBV com origem na Suécia (1999) foi observada como grupo externo em ambos os parâmetros coalescentes utilizados (tamanho populacional constante e crescimento populacional exponencial), isso com base nas 10,000 árvores coletadas (Figura 20).
Figura 20. Análises do Densitree baseado em 10,000 árvores provenientes da Inferência Bayesiana frente as sequências S1 do AvCoV. Árvores consenso e a mais provável topologia das árvores executada pela análise dos parâmetros: coalescente população constante (a) e coalescente população exponencial (b), respectivamente. Legendas: abreviaturas dos países: BR = Brasil; SE = Suécia; TH = Tailândia. Hospedeiros: Pon = Pombo-comum; Vul = Urubú-de-cabeça-preta; Spa = Gavião-carijó; Owb = Coruja-do-mato; Owl = Coruja-orelhuda; Wpe = Pica-pau; Gre = Bem-te-vi; Par = Papagaio-de-peito-roxo; Red = Pavó; Ckn = Galinha.
Com base nos resultados obtidos nas análises do Densitree, árvores de MCC foram construídas através da imposição de um relógio molecular relaxado usando os mesmos parâmetros coalescentes utilizados acima. Onde, uma variante do IBV da Suécia (1999) foi inferida como o MRCA das variantes dos AvCoVs investigados neste estudo (Figura 21), sugerindo que uma variante isolada 15 anos atrás pode ter sido responsável pelo surgimento das novas variantes dos AvCoVs presentes nos animais silvestres e sinantrópicos.
Figura 21: Árvores de MCC oriundas da análise Bayesiana da porção gênica S1 dos AvCoVs. Dados para o relógio molecular relaxado relacionados com a coalescente população constante (a) e coalescente população exponencial (b) são mostrados. Obs.: Ckn (Suécia) = IBV isolado de Gallus
Ckn (Sweden)
(a)
gallus (Galinha) com origem na Suécia. Os anos exibidos nas árvores indicam a data de coleta das
sequências. Os números entre os ramos representam a probabilidade posterior.
Seguindo com as análises e a procura de mais detalhes sobre os resultados mostrados nas Figuras 20 e 21, implementou-se o método de BBM com o objetivo de traçar uma reconstrução biogeográfica das faixas ancestrais dos AvCoVs detectados. Primeiramente, foram analisados os nós ancestrais do IBV amostrados da espécie Gallus gallus (Galinhas). Os nós ancestrais 78 (C, D, E e F que indicam um ancestral Europeu), 80 (I, J e L possui faixas ancestrais provenientes da Austrália, Canadá e Coréia do Sul), 92 (P e N possui faixas ancestrais no Iraque e China) e 93 (O, P e Q têm faixas ancestrais na Eslovênia, Itália e Iraque), todos estes nós exibiram ambiguidade sugerindo a presença de dois, três e quatro diferentes reconstruções de faixas ancestrais (ou seja, para cada nó analisado, existe mais de um ancestral biogeográfico). Em outras palavras, as análises realizadas pelo BBM inferiu dois, três e quatro eventos de dispersão envolvendo países de diferentes continentes (América do Norte, Europa, Oceania e Ásia) (Figura 22).
Analisando as faixas ancestrais das variantes dos AvCoVs (destacados com traços azuis, Figura 22) revelou-se que a maioria das amostras tinham identidade brasileira. No entanto, os nós ancestrais 109 (A e R) e 111 (A e D) tiveram faixas de ancestralidade biogeográfica proveniente de outros países. Dados das árvores MCC (Figura 21) tinha mostrado que uma variante do IBV da Suécia (1999) foi o ancestral comum mais próximo; com base nó 111, a frequência desta ancestralidade é de 0,84% para A (Brasil) e D (Suécia); 0,19% (D) e 0,64% (proveniente de outra faixa ancestral) (Figura 22).
Nossas análises podem ser sustentadas pelos relatos de Farsang et al. (2002), que relataram que antes de 1997 não se aplicavam vacinas contra a BI na Suécia. Diversos casos que ocorreram em diferentes fazendas entre 1994 e 1998 foram previamente diagnosticados como BI. Todos os
surtos causaram problemas na produção de ovos e afetaram a produção de frangos de corte.
Figura 22: Reconstruções dos ancestrais biogeográficos implementado no software RASP (a)
(b)
(c)
usando o método de BBM. Áreas de reconstruções biogeográficas do RASP (a). Cada cor seguido por uma letra representa um país assumindo os possíveis intervalos ancestrais para os diferentes nós (b). Possíveis rotas do AvCoV hospedado em aves até alcançar as amostras com identidade brasileiras avaliadas no estudo (c). Resultados das distribuições ancestrais do nó 111 mostrando o percentual de identidade ancestral entre aves suecas e brasileiras (d). Os traços azuis na árvore representam as sequências obtidas neste estudo. As probabilidades de faixas ancestrais alternativas são mostrados nos gráficos de pizza em cada nó. Setas amarelas destacam os resultados dos nós ancestrais 111 e 109. Abreviaturas na figura: BR = Brasil; SE = Suécia; TH = Tailândia.
10. Análises de Relógio Molecular
A hipótese do relógio molecular foi avaliada utilizando o Teste da Razão de Verossimilhança (LRT) (Posada e Crandall, 1998), que compara os valores de verossimilhança das topologias assumindo e não assumindo o relógio molecular.
Nestas análises, foram analisados os tempos de divergências das sequências pertencentes ao Clado 1 [AvCoV detectado em aves silvestres e sinantrópicas] e Clado 2 [IBV isolado de Gallus
gallus (Galinhas)], sendo que a taxa de evolução para as sequências do Clado 1 e 2 foram
calculados em 1,59 x 10-2 e 2,21 x 10-4 substituições por sítio por ano, respectivamente (Tabela 8). As sequências pertencentes ao Clado 2 seguiu o modelo de relógio molecular de acordo com a taxa evolutiva do IBV (Jackwood et al., 2012). Nas nossas análises, a hipótese de relógio molecular foi aceita em ambos os clados analisados.
Tabela 8: Razão evolucionária dos AvCoVs detectados em diferentes animais
Sequências Hospedeiros Modelo de relógio
Razão evolucionária *HPD Clado 1 Aves silvestres e sinantrópicas Relaxado 1,599 x 10-2 7,6111 x 10-3 a 2,52 x 10-2 Clado 2 Galinhas Estrito 2,21 x 10-4 1,5416 x 10-5 a 4,4915 x 10-4 *95% HPD = “Highest Probability Density Interval”
Comparando com outros CoVs, estudos anteriores estimaram uma alta taxa evolutiva de 0,3-0,6 × 10-2 para algumas variantes do IBV isoladas de Gallus gallus (Cavanagh et al., 1998). Alta taxa de evolução viral não somente pode conduzir à geração de uma grande diversidade de variantes e de genótipos de espécies de CoVs, mas também para novas espécies que podem se adaptar a novos hospedeiros e nichos ecológicos (Woo et al., 2009).
Estudos recentes, por exemplo, identificaram que CoVs isolados em pavão (Pavo cristatus), perdiz (Alectoris sp.), galinha d’angola (Numida meleagris) e marrecos (Anas sp.) exibiam características genômicas próximas ao IBV (IBV-like) (Liu et al., 2005; Chu et al., 2011). Adicionalmente, o contato próximo entre animais infectados e suscetíveis facilita a transmissão dos vírus de RNA entre as espécies, principalmente quando dois hospedeiros estão intimamente relacionados evolutivamente (Cavanagh, 2005), como é o caso de galinhas e codornas, que pertencem à família Phasianidae.