Análises de biologia molecular

A identificação das bactérias presentes no lodo foi realizada por técnica de biologia molecular (PCR-DGGE), onde se efetuou a extração do DNA de três amostras, sendo elas:

 Amostra 1: Lodo da Casan in natura;

 Amostra 2: Biofilme do biorreator operado em processo contínuo;

 Amostra 3: Biofilme do biorreator em batelada.

A Figura 4.3 apresenta o gel de DGGE para o Domínio Bacteria representando as três amostras.

Figura 4.3 – Gel do DGGE para as três amostras analisadas, sendo que a Banda 1 corresponde a Amostra 1; Banda 2: Amostra 2 e; Banda 3: Amostra3.

Através da fotografia do gel, representado pela Figura 4.3, pode se observar as bandas visíveis das amostras 1, 2 e 3, dessa forma ocorreu uma adequada extração do DNA. O gel mostra ainda que as amostras 2 e 3 modificaram sua composição bacteriana, diferenciando-se do inoculo, amostra 1, pois a banda 1.1, que estava presente no inoculo, não foi mais encontrada nos biorreatores, indicando que esta população de bactérias desapareceu após o processo de adaptação com os compostos BTX. Com relação às bandas 2.1 e 2.2 e 3.1 e 3.2 da amostra 3 (e as demais não enumeradas), foi observado que estas bandas apareceram durante a adaptação, dessa forma não existiam no inóculo ou existiam em uma quantidade muito pequena, mostrando que o contato das bactérias com os compostos BTX modifica a composição química do micro- organismos.

Para a identificação das bactérias detectadas nas bandas, após o isolamento do DNA genômico, as amostras foram amplificadas e encaminhadas para o sequenciamento. Para a identificação das bactérias presentes através do método do DGGE, todas as bandas selecionadas que apresentaram amplificação foram sequenciadas. Os cromatogramas

3.2 3.1 2.2 1.1

obtidos foram examinados, para verificação da qualidade das sequências (o cromatograma de uma amostra pode ser observado pela Figura 4.4), através do programa BioEdit Sequence Alignment Editor e então comparadas às sequências depositadas no banco de dados público GeneBank do NCBI. Sempre se procurou avaliar o histórico de cada bactéria, onde muitas haviam sido identificadas em ambientes aquáticos. A Figura 4.4 representa o cromatograma de um DNA de uma espécie de bactéria presente na Amostra 1. Observa-se que os picos apresentam-se bem definidos, assim a amostra apresenta pouca possibilidade de erros do código genético (ACDG).

Figura 4.4 – Cromatograma obtido no sequenciamento de uma bactéria. As Tabelas 4.1 e 4.2 e 4.3, mostram os resultados obtidos através do sequenciamento das bandas do gel de DGGE do domínio Bacteria, para a amostra 1, amostra 2 e amostra 3, respectivamente. Em cada sequência se identificou o organismo cuja sequência do rRNA 16S é mais próximo no GenBank. Contudo, para se obter uma maior segurança quanto ao grau de similaridade na comparação de sequências com as depositadas em banco de dados observou-se o histórico das mesmas para associar-se ao ambiente do isolamento, sendo que também se considerou somente amostras com similaridade de ≥ 90%.

Tabela 4.1 – Percentual de similaridade baseado no alinhamento do gene RNAr 16S do Domínio Bacteria do lodo obtido da Casan – Inóculo

No de acesso Micro-organismo Similarida de (%) Referência 025761. 1 Soehngenia saccharolytica strain BOR-Y 91 Parshina et al. (2003) 044365. 1 Micrococcus endophyticus

strain YIM 56238 90 Chen et al. (2009) 044624.

1 Clostridium cellulosi 91 Rainey et al. (1993) 043766.

1

Runella defluvii strain

EMB13 90 Lu et al. (2007)

024735. 1

Tetrasphaera elongata strain

Lp2 93 Hanada et al. (2002) 024975. 1 Tetrasphaera australiensis strain 109 93 Maszenan et al. (2000) Para a amostra coletada da Casan que foi a biomassa in natura e que foi submetida à adaptação para biodegradar os compostos BTX, foram identificados dentro do percentual de similaridade descrito na Tabela 4.1, um total de 6 espécies de bactérias presentes (com similaridade maior ou igual a 90%).

A Tabela 4.2 indica o percentual de similaridade para a amostra de lodo aeróbio adaptado em processo contínuo.

Tabela 4.2 – Percentual de similaridade baseado no alinhamento do gene RNAr 16S do Domínio Bacteria da amostra de biofilme presente na coluna.

No de

acesso Micro-organismo

Similarida

de (%) Referência 024570.1 Escherichia coli strain U 5/41 90 Cilia et al. (1996) 036794.1 Klebsiella pneumoniae strain

DSM 30104 92 Ludwig et al. (1995) GU32991 6.1 Pseudomonas aeruginosa strain OSBH4 100 Maity et al. (2010) 041715.1

Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 = LMG 11199 strain

ATCC 17588

91 Galdzicka et al. (2011)

Muitos componentes aromáticos simples, entre eles os BTX, ácido benzoico, ácido fenil acético e ácido fenilpropiônico, são degradados por bactérias aeróbias, como Pseudomonas, Acinetobacter (Gram negativas), Rhodococcus (Gram positivas), e também por Escherichia coli (Gram negativa) como descrito por (BUGG and WINFIELD, 1998).

Pela Tabela 4.2, pode-se observar a presença de bactérias pertencentes ao gênero Pseudomonas (gram negativas), estas geralmente utilizam um número elevado de compostos orgânicos como fontes de carbono, por isso, desempenham um papel importante na degradação de compostos orgânicos solúveis derivados da decomposição de plantas e animais, como de xenobióticos (exemplos, pesticidas derivados do petróleo, inseticidas, etc.).

A Tabela 4.3 representa o percentual de similaridade das bactérias presentes na amostra de biofilme presente no biorreator em batelada.

Tabela 4.3 – Percentual de similaridade baseado no alinhamento do gene RNAr 16S do Domínio Bacteria da amostra de biofilme presente no biorreator em batelada. No de acesso Micro-organismo Similaridade (%) Referência EU74458 7.1 Streptomyces sp. A00005 95 Wu et al. (2009) JQ336981 .1

Pseudomonas veronii strain

MML1963 96 Ramprasath et al. (2011) 044293.1 Pseudoxanthomonas sacheonensis strain BD-c54 90 Lee et al. (2008) De acordo com a literatura as bactérias do gênero Pseudomonas também são encontradas em sistemas de tratamento de esgotos domésticos. De acordo com Akinde e Obire (2008), são as espécies bacterianas mais predominantes e a sua prevalência pode ser atribuída à sua versatilidade metabólica e à sua distribuição ubíqua na natureza. No entanto, pode se destacar que no inóculo, amostra 1, não foi identificado o gênero Pseudomonas, o que pode ser explicado pela baixa quantidade deste tipo de bactéria, sendo talvez estas desconsideradas no momento de escolha das bandas do gel de DGGE da amostra 1. Contudo, após a realização do processo adaptativo, os biorreatores tanto em fluxo contínuo quanto em batelada apresentaram este gênero, sugerindo, dessa

forma, que houve um crescimento do gênero Pseudomonas devido a maior afinidade com os compostos BTX que os demais gêneros listados na Tabela 4.1.

Ridgway et al. (1991) mostraram que 87% das estirpes de um conjunto de 300 isoladas a partir de um aquífero contaminado e que degradavam gasolina foram identificadas como Pseudomonas spp. Shim et al. (2005) também relatam que Pseudomonas putida e Pseudomonas fluorescens podem efetivamente degradar benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos. Também pode se destacar que os micro-organismos identificados no inóculo, amostra 1, não foram identificados nas amostras 2 e 3 (após o processo adaptativo). Isto pode ser explicado pelo fato destas bactérias se apresentarem numa quantidade pequena e dessa forma, podem ter sido desconsideradas no momento de escolhas das bandas do Gel de DGGE, ou mesmo, elas podem não ter sobrevivido ao processo de adaptação, devido aos compostos BTX apresentarem elevada toxicidade para muitos tipos de micro-organismos.