Análises estatísticas

A DL50 de ingestão e contato com base na mortalidade por dose foi calculada

utilizando a Análise Probit com probabilidade máxima, usando o programa estatístico Minitab (Minitab Inc 2001). Os resultados da avaliação da atividade motora, consumo de alimento, viabilidade de cria, desenvolvimento populacional e expressão gênica foram submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida do Teste de Tukey, sendo considerados estatisticamente diferentes quando P<0,05 (Zar 2010).

3. Resultados

A DL50 (24h) de ingestão foi de 0,19 ± 0,06 µg/abelha, obteve-se a equação Y =

0,6492 + 33,73 X - 50,05 X**2 (Figura 1A). A DL50 (24h) de contato foi de 0,009 ±

0,003µg/abelha, obteve-se a equação Y = 2,762 + 166,9 X - 1580 X**2 + 4314 X**3 (Figura 1B). O fipronil demonstrou maior toxicidade quando administrado por contato. As alterações comportamentais observadas incluíram agitação, convulsão, tremores e paralisia nas abelhas tratadas com doses entre 0,01 e 0,35µg nos testes de ingestão; e entre 0,007 e 0,224μg nos testes de contato, 30, 60, 90 e 120 minutos após sua exposição.

Figura 1. Ensaio de toxicidade aguda de Apis mellifera africanizadas expostas a doses

do fipronil para cálculo da DL50. A. Exposição por ingestão; B. Exposição por Contato.

As abelhas intoxicadas por ingestão ou contato com a DL50 levaram maior

tempo para percorrer o trajeto avaliado (50 cm) nos testes de atividade motora, quando comparadas ao grupo controle (Tabela 2). A redução da atividade motora observada em abelhas expostas no tempo 24 horas pode estar relacionada ao efeito prolongado do fipronil ou a formação de metabólitos tóxicos.

Tabela 2. Médias e desvio-padrão do tempo (s) gasto pelas abelhas Apis mellifera

africanizadas para percorrer 50 cm após exposição por ingestão ou contato com a DL50

do inseticida fipronil, nos tempos 1, 4 e 24 horas.

Tratamento 1 h 4 h 24 h

Controle 13,3±5,9a 17,5±5,1a 17,6±3,5a

DL50 Ingestão (0,2µg/abelha) 29,8±8,6b 27,2±6,9b 22,4±7,7b

Controle 13,7±3,8a 16,8±4,8a 17,7±5,5a

DL50 Contato (0,009µg/abelha) 32,8±8,1b 28,6±9,4b 26,2±9,0b

Letras minúsculas diferentes, na mesma coluna, indicam diferença estatística entre médias (P<0,05), usando o Teste de Tukey.

Na exposição das abelhas as DS do fipronil houve diferença no tempo para percorrer o trajeto avaliado (50 cm), 04 horas após sua exposição por ingestão e 24 horas após exposição por contato, quando comparadas ao grupo controle (Tabela 3). As alterações motoras observadas nas abelhas expostas a DS do fipronil por contato no tempo 24 horas podem ser devidos a maior toxicidade desse inseticida utilizando essa

via de exposição. O efeito prolongado do fipronil ou a formação de metabólitos tóxicos em diferentes tempos podem ter contribuído para a redução da atividade motora das abelhas.

Tabela 3. Médias e desvio-padrão do tempo (s) gasto pelas abelhas Apis mellifera

africanizadas para percorrer 50 cm após exposição por ingestão ou contato com a dose subletal (DS) do inseticida fipronil, nos tempos 1, 4 e 24 horas.

Tratamento 1 h 4 h 24 h

Controle 13,2±6,8a 11,7±3,8a 17,8±3,6a

DS Ingestão (0,0004µg/abelha) 12,2±4,5a 16,6±3,9b 16,2±4,1a

Controle 13,8±4,1a 19,3±6,9a 17,9±4,2a

DS Contato (0,000018µg/abelha) 15,6±3,9a 17,3±5,1a 20,3±7,1b Letras minúsculas diferentes, na mesma coluna, indicam diferença estatística entre médias (P<0,05) usando o Teste de Tukey.

O consumo de xarope de açúcar fornecido aos enxames não diferiu (P>0,05) entre os enxames do grupo tratado e controle, sendo a média de consumo de 2064,3 ± 200 mL e 1950,2 ± 50 mL, respectivamente.

Nos enxames que receberam alimento com a DS do fipronil, houve redução da eclosão de ovos a partir da terceira quinzena; redução do número de pupas com 19 e 12 dias de idade a partir da primeira e segunda quinzena, respectivamente, em comparação aos enxames do grupo controle (Tabela 4).

Tabela 4. Médias e desvio padrão da viabilidade de cria (%) de enxames de Apis mellifera africanizadas que receberam xarope de açúcar puro (controle) ou contaminado com a dose subletal (DS) do inseticida fipronil (8µg L-1_).

Eclosão de ovos Número de pupas 12º dia Número de pupas 19º dia Quinzena Controle DS (8µg L-1_{) Controle DS (8µg L}-1_{) Controle DS (8µg L}-1₎

1ª 93,5±8,1a 93,9±5,40a 87,2±12,2a 69,2±12,7a 71,5±22,0a 29,2±17,7b

2ª 91,2±1,8a 62,6±13,6a 84,7±4,90a 22,7±14,9b 70,9±5,2a 5,3±3,50b

3ª 90,6±3,2a 55,4±32,8b 87,7±2,40a 16,1±22,2b 72,8±4,7a 6,22±0,7b

4ª 94,6±1,5a 10,1±15,2b 89,6±2,90a 0,0± 0,0b 81,4±4,5a 0,0±0,0b Letras minúsculas diferentes, na mesma linha, indicam diferença estatística entre médias P<0,05) usando o Teste de Tukey.

Houve redução significativa na área de postura a partir da 6ª semana, da área de cria aberta a partir da 3ª semana e de cria fechada a partir da 4ª semana nos enxames alimentados com a DS do fipronil, em comparação aos enxames do grupo controle (Tabela 5). Durante as revisões, as abelhas que receberam dieta contaminada apresentaram inércia, caracterizada pela redução da movimentação, voo e menor comportamento de defesa das colônias; não foi observada mortalidade de abelhas no interior ou no entorno das colmeias. Houve redução gradual do número de abelhas adultas nas colônias. Nenhuma colmeia apresentou sintomas de doenças nas áreas de cria ou abelhas adultas e não houve infestação de V. destructor durante todo período experimental.

O desenvolvimento das larvas a partir da 8ª semana nos enxames expostos à DS do fipronil foi totalmente comprometido. Houve abandono de 100% das colmeias pelas abelhas adultas 60 dias após sua exposição à DS do fipronil. As colmeias abandonadas apresentaram estoques de mel e pólen. Todas as colônias do grupo controle mantiveram desenvolvimento inalterado e estavam vivas vinte semanas após o abandono das colmeias do grupo tratamento.

Tabela 5. Médias e desvio padrão das áreas de postura, cria aberta e cria fechada (cm²)

de enxames de Apis mellifera africanizadas que receberam xarope de açúcar puro (controle) ou contaminado com a dose subletal (DS) do inseticida fipronil (8µg L-1_).

Área de Postura Área de Cria Aberta Área de Cria Fechada Semana Controle DS (8µg L-1_{) Controle DS (8µg L}-1_{) Controle DS (8µg L}-1₎

1ª 48,2±24,4a 79,4±19,9a 40,2±31,9a 27,2±12,2a 104,2±66,0a 116±39,2a 2ª 46,0±14,5a 55,8±12,6a 43,8±23,0a 55,0±17,6a 73,8±55,2a 19,8±12,1a 3ª 60,2±36,2a 58,2±16,4a 41,4±13,4a 9,6±7,1b 87,2±60,6a 36,4±18,9a 4ª 84,4±70,1a 24,4±8,0a 55,0±37,6a 7,4±4,1b 72,8±18,8a 5,0±6,0b 5ª 90,6±77,5a 17,8±10,3b 76,0±62,2a 5,8±6,4b 73,0±51,5a 0,0±0,0b 6ª 40,6±12,1a 13,2±12,2b 87,0±74,2a 3,8±6,4b 96,0±61,2a 3,2±5,2b 7ª 28,4±9,8a 8,8±12,0b 36,0±12,7a 7,4±10,1b 111,4±73,1a 5,0±10,1b 8ª 28,4±5,0a 9,4±12,9b 25,2±9,8a 3,0±5,2b 78,4±67,5a 5,0±7,2b 9ª 30,6±9,7a 0,0±0,0b 24,0±3,7a 0,0±0,0b 33,8±11,79a 0,0±0,0b

Média 50,8±41,4a 29,6±28,8b 47,6±39,8a 13,2±18,6b 81,1±54,8a 21,1±38,5b

Letras minúsculas diferentes, na mesma linha, indicam diferença estatística entre médias (P<0,05), usando o Teste de Tukey.

A expressão do gene defensina 1 em abelhas coletadas em colmeias expostas a DS do inseticida fipronil não foi alterada, em comparação ao grupo controle (Tabela 6).

Tabela 6. Médias e desvio padrão da quantificação relativa do gene defensina I em Apis mellifera africanizadas coletadas em colônias que receberam xarope de açúcar puro (controle) ou contaminado com a dose subletal (DS) do inseticida fipronil (8µg L-1).

Tratamento Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28

Controle 0,99±0,55a 0,92±0,45a 1,14±0,67a 0,82±0,54a

DS (8µg L-1_{) 0,97±0,46a 0,90±0,64a 0,88±0,88a 0,70±0,67a}

Letras minúsculas diferentes, na mesma coluna, indicam diferença estatística entre médias (P<0,05) usando o Teste de Tukey.

4. Discussão

Os resultados para a DL50 de ingestão e contato indicaram alta toxicidade do

inseticida fipronil para A. mellifera africanizadas. De acordo com Johansen e Mayer (1990) os inseticidas são considerados altamente tóxicos para abelhas quando apresentam DL50 inferior a 2µg por abelha. Os resultados obtidos são semelhantes aos

relatados por Defra (2007) que obteve DL50 de ingestão de 0,12 µg/abelha e Mayer e

Lunden (1999) que obtiveram DL50 de contato de 0,013 µg/abelha.

Os ingredientes inertes, presentes em formulações comerciais de agrotóxicos, são responsáveis por potencializar o efeito dos ingredientes ativos e de acordo com Ciarlo et al. (2012) podem ser tóxicos para as abelhas. Apesar disso, no presente estudo optou-se pela utilização da formulação comercial do fipronil que é utilizada nas pulverizações em campo, a fim de simular da maneira mais próxima possível a exposição das abelhas a esses produtos.

As alterações comportamentais das abelhas, observadas durante os testes de toxicidade, incluíram agitação, convulsão, tremores e paralisia. Essas alterações podem ser devido à ação antagônica do fipronil sobre o neurotransmissor ácido gama amino butírico (GABA), que atua impedindo a entrada dos íons Cl- _{nas células nervosas de}

Demonstrou-se que abelhas sofreram alteração na atividade motora após serem expostas por ingestão ou contato à DL50 e à DS do inseticida fipronil. A atividade

locomotora em insetos é regulada pela sinalização GABAergica que pode ser bloqueada devido a ligação do fipronil ao neurotransmissor GABA (Narahashi et al. 2010), o que justifica os resultados obtidos neste estudo. A redução da atividade motora observada nos diferentes tempos avaliados indica uma ação prolongada desse inseticida sobre o sistema nervoso dos insetos, ou pode estar relacionada à degradação do fipronil em metabólitos sulfona e disulfenil, que também podem prejudicar a atividade motora (Hainzl et al. 1998). Alterações na atividade locomotora em abelhas expostas por contato a DS de 0,00001µg fipronil foram relatadas por Aliouane et al. (2009).

A exposição das abelhas ao fipronil durante a coleta de néctar, pólen, resinas e água, bem como sua presença em colônias de A. mellifera (Mullin et al. 2010; Pareja et al. 2011; Lambert et al. 2013) representa risco para esses polinizadores, que podem sofrer alterações comportamentais e ter a atividade motora prejudicada. De acordo com Aliouane et al. (2009), as modificações de uma ou mais funções das abelhas pode prejudicar a atividade de forrageamento e comprometer sua sobrevivência.

Não se observou diferença no consumo de xarope de açúcar fornecido às colônias contendo a DS do fipronil em relação ao grupo controle, indicando ausência de efeitos anti-alimentares ou repelentes desse inseticida para as abelhas. Esse fato pode contribuir para a exposição repetida das abelhas a esse inseticida em campo, ocasionando o acúmulo de recursos contaminados em colmeias, como verificado em estudos realizados por Pareja et al. (2011).

Nos testes de campo, verificou-se progressiva redução da viabilidade de cria, desenvolvimento populacional e alterações comportamentais nas abelhas adultas em enxames expostos à DS do fipronil. Esses resultados possivelmente se devem a utilização de alimento contaminado com fipronil para alimentar as larvas em desenvolvimento e ao consumo repetido de alimento contaminado pelas abelhas adultas. O fipronil pode ter sido degrado no decorrer do estudo, da mesma forma que ocorre quando aplicado em campo, dando origem aos metabólitos sulfona e disulfenil que também apresentam alta toxicidade (Hainzl et al. 1998).

O fornecimento de xarope de açúcar contaminado com a DS do fipronil durante o período do inverno garantiu sua utilização imediata pelas abelhas, já que nesse

período não existem outras fontes de néctar disponíveis na área de estudo. Em períodos de floradas, possivelmente as abelhas coletariam néctar na vegetação nativa, interferindo nas análises para a avaliação dos efeitos da DS. A exposição de enxames à DS do fipronil no período do inverno revelou alta toxicidade desse inseticida para as abelhas adultas e em desenvolvimento. Deve-se considerar que no inverno as abelhas apresentam maior longevidade (Page e Peng 2001) e consomem recursos estocados nas colônias, aumentando sua exposição a agrotóxicos. A maior perda de enxames no inverno (Oldroyd 2007; Williams et al. 2010; Kaplan 2014), pode estar relacionada ao efeito de doses subletais do inseticida fipronil.

A exposição dos enxames ao fipronil e sua utilização pelas abelhas pode prejudicar diversas atividades na colônia. A coleta de recursos pode ser prejudicada devido a alterações na atividade motora de abelhas campeiras, que ao consumir os recursos contaminados apresentam maior letargia. Alterações motoras podem ser mais intensas em períodos de escassez de floradas, quando as abelhas são expostas à DS de fipronil presente em alimentos contaminados, devido às repetidas exposições ao inseticida.

O neurotransmissor GABA que é afetado pelo fipronil também regula a contração muscular das abelhas (Narahashi et al. 2010), importante na geração de calor para manutenção da temperatura dos enxames. Devido ao resfriamento do ambiente no inverno, os enxames expostos a DS do fipronil podem ter o aquecimento do ninho comprometido, prejudicando a criação das larvas. O desenvolvimento das abelhas em colônias expostas a DS do fipronil também pode ser prejudicado, devido à alta toxicidade desse inseticida para abelhas adultas e para larvas, conforme resultados apresentados no presente estudo.

A progressiva redução do número de abelhas adultas nas colônias expostas a DS do fipronil, em função do comprometimento do desenvolvimento populacional das colônias, ausência de abelhas mortas no interior ou nas proximidades das colmeias, abandono dos enxames pelas abelhas adultas deixando estoques de mel e pólen, observados no presente estudo assemelham-se ao fenômeno Colony Collapse Disorder (CCD) descrito por Van Engelsdorp et al. (2009). Estudo conduzido por Lu et al. (2012) verificaram que a exposição de enxames a DS de inseticida prejudicou o desenvolvimento das colônias, seguida do seu abandono. É importante destacar que as

colônias do grupo controle utilizadas no presente estudo mantiveram desenvolvimento inalterado e se mantiveram ativas até a 20ª semana de avaliação. Esse dado confirma que a perda dos enxames do grupo tratamento foi devida à exposição à DS do fipronil. As observações realizadas nesse estudo reforçam as suspeitas de que doses subletais de inseticidas podem ocasionar ou facilitar a ocorrência do fenômeno Colony Collapse Disorder (CCD), conforme sugerido por Van Engelsdorp et al. (2009) e Lu et al. (2012). A utilização de agrotóxicos em cultivos agrícolas pode contribuir para a contaminação de todos os recursos coletados pelas abelhas, devido à dispersão desses produtos pelo vento durante sua aplicação. Considerando a presença do fipronil em colônias de abelhas abandonadas, nas quantidades entre 40 a 100µg kg-1 _{e 150 a 170µg}

kg-1 _{em amostras de mel e abelhas, respectivamente (Pareja et al. 2011) e sua detecção}

em menores doses em estudos realizados por Mullin et al. (2010), Pareja et al. (2011) e Lambert et al. (2013), os resultados do presente estudo demonstram a importância da adoção de estratégias que visem reduzir sua utilização.

Em países da União Europeia a taxa de aplicação do fipronil varia entre 17,5 a 44g/i.a/ha, sendo que os cultivos tratados com essa quantidade de ingrediente ativo apresentaram respectivamente 2,3 e 6,4μg do fipronil kg-1 _{no pólen (European Food}

Safety Authority 2013) o que confirma a exposição dos polinizadores a esse inseticida em doses subletais. O uso do fipronil em doses entre 80 a 400g/i.a/ha em países da América Latina (Basf The Chemical Company 2014) representa grandes riscos para os polinizadores, devido à alta concentração desse inseticida que podem estar presentes em recursos coletados por esses insetos.

A expressão do gene defensina 1 não foi alterada em abelhas coletadas nas colmeias expostas a DS do fipronil ao longo do estudo. O gene defensina 1 codifica a expressão de um peptídeo antimicrobiano do sistema imunológico das abelhas, sendo que a redução da sua expressão pode tornar as abelhas mais suscetíveis ao ataque de microrganismos (Ilyasov et al. 2012). As abelhas são normalmente expostas a microrganismos encontrados naturalmente nas colônias (Evans et al. 2006), o que proporciona um desafio para as abelhas, tornando necessária a síntese de proteínas de defesa. A coleta de abelhas diretamente nas colônias para posterior análise da expressão do gene defensina 1 dispensou a exposição artificial das abelhas a microrganismos.

Futuros estudos são sugeridos visando avaliar a expressão de genes do sistema imunológico de abelhas expostas a doses subletais de inseticidas utilizados em cultivos agrícolas e na presença de parasitas causadores de doenças em abelhas, como o ácaro V. destructor e patógenos como Nosema sp., que de acordo com Connolly (2013) podem prejudicar a sanidade das abelhas. Estudos realizados por Boncristiani et al. (2012) verificaram alteração da expressão de genes do sistema imunológico em abelhas expostas doses subletais de acaricidas e na presença do ácaro V. destructor.

A alta toxicidade do fipronil para os polinizadores levou países como a França, Itália, Alemanha e Eslovênia a proibirem sua utilização (Ghisi et al. 2011). Os resultados apresentados no presente estudo demonstram os riscos da utilização do fipronil para A. mellifera, comprovando a ocorrência de alterações comportamentais e locomotoras. Além disso, o desenvolvimento e manutenção de colônias expostas à dose subletal do fipronil foi comprometido, culminando no colapso e abandono dos enxames. Diante dos resultados apresentados, sugere-se a revisão da autorização do uso do fipronil em países onde é autorizado.

Estudos em longo prazo para detecção de efeitos tóxicos de doses subletais de agrotóxicos a que as abelhas são expostas são sugeridos a partir dos resultados apresentados no presente estudo. É importante que esses estudos sejam realizados em períodos críticos para a sobrevivência das abelhas, como no inverno, quando os recursos potencialmente contaminados por agrotóxicos são consumidos pelas abelhas.

A avaliação da toxicidade dos agrotóxicos para as abelhas considerando seus efeitos subletais durante o inverno, pode contribuir para melhor entendimento do declínio dos polinizadores, permitindo a adoção de estratégias que reduzam a exposição das abelhas a essas substâncias, como descritas por Hooven et al. (2013). A redução mundial do número de enxames de A. mellifera pode prejudicar a polinização de cultivos agrícolas e áreas de vegetação nativa (Aizen e Harder 2009) sendo fundamental reduzir a utilização de inseticidas altamente tóxicos, que são responsáveis pelo declínio desses polinizadores.

Conclui-se que o fipronil apresenta efeitos altamente tóxicos para as abelhas Apis mellifera, ocasionando alterações que podem contribuir para o colapso das colônias, devendo ser estudadas medidas que possibilitem sua substituição por produtos com menor toxicidade para esses polinizadores.

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