Análises Físico-Químicas

5.2.4.1 Determinação de compostos fenólicos totais (CFT)

Os compostos fenólicos foram extraídos de acordo com a metodologia proposta por Mancini et al. (2015), com modificações. As amostras de hambúrgueres (10 g) foram agitadas por 1 minuto em turrax juntamente com 20 mL de acetona 55 % (v/v), sendo centrifugadas à 2660 g por 20 minutos (Centrifuge MPW-351, Med. Instruments, Varsóvia, Polônia) e filtradas em papel filtro qualitativo.

A determinação de CFT foi realizada no bagaço da maçã silvestre M. platicarpa e nos extratos fenólicos dos hambúrgueres ‘controle’ e ‘controles do bagaço’ (0,2 e 2,0 %), de acordo com a metodologia de Singleton e Rossi (1965) no dia de produção. Os resultados foram expressos em gramas equivalentes de ácido 5-cafeoilquínico por quilograma de hambúrguer (g

CARNE E TOUCINHO ÁGUA SAL CONTROLE BAGAÇO 0,2 % BAGAÇO 2 % CONTROLE BAGAÇO 0,2 % CONTROLE BAGAÇO 2 % CARNE E TOUCINHO ÁGUA SAL CONTROLE HB 0,2 % BAGAÇO 0,2 % BAGAÇO 2 % SAL CONTROLE BAGAÇO O,2 % CONTROLE BAGAÇO 2 % INÓCULO E. Coli HB 2 %

0,001].

Vale a pena ressaltar que a análise de CFT foi realizada na amostra controle pelo fato das proteínas (ou aminoácidos) serem interferentes analíticos do método de Folin-Ciocalteu (EVERETTE et al., 2010), sendo que os resultados obtidos foram descontados das amostras incorporadas de bagaço.

5.2.4.2 Determinação de flavonoides totais

Foram determinados nos extratos fenólicos dos hambúrgueres ‘controle’ e ‘controles do bagaço’ (0,2 e 2,0 %), bem como no bagaço da cultivar silvestre M. platicarpa conforme método proposto por Zhishen; Mengcheng e Jianming (1999). A absorbância foi medida a 510 nm em espectrofotômetro (modelo Mini UV 1240, Shimadzu, Tokyo, Japão). Os resultados foram comparados com curva padrão de catequina (y = 0,0012x + 0,01; R2 = 0,998) e os resultados expressos em miligrama de equivalente de catequina por quilograma de hambúrguer (mg CAT/Kg).

5.2.4.3 Atividade antioxidante

A atividade antioxidante foi determinada no bagaço da cultivar silvestre M. platicarpa e nos extratos fenólicos obtidos dos seguintes hambúrgueres: controle, controle com 0,2 % de bagaço e controle com 2,0 % de bagaço; no dia de produção. Três métodos foram utilizados, e todos os resultados foram expressos em mmol equivalente de Trolox por kg de hambúrguer (mmol TE/kg), sendo eles:

a) Método de captura de radical DPPH: de acordo com o descrito por Brand-Williams; Cuvelier e Berset (1995). A absorbância foi medida a 517 nm e os resultados foram expressos comparado à curva de calibração (y= -0,0006x + 1,4144; R2= 0,9874; 100-1000 µmol TROLOX/kg).

b) Método de captura de radical ABTS: realizado de acordo com o descrito por Re et al. (1999); a absorbância foi medida a 734 nm e os resultados foram expressos comparado à curva de calibração (y = -0,0013x + 0,5697; R2 = 0,9940; 50-300 µmol TROLOX/kg).

c) Poder antioxidante de redução do ferro (FRAP): de acordo com o descrito por Benzie e Strain (1996), sendo as medidas de absorbância realizadas a 593 nm. Os resultados foram comparados com curva padrão (y = 0,0006x – 0,0341; R2 = 0,9942; 100-1000 µmol TROLOX/kg).

Para a determinação da cor dos hambúrgueres, foi realizada leitura na superfície, em diferentes pontos das amostras controle, controle 0,2 % de bagaço e controle 2,0 % de bagaço, armazenadas à 8 ºC por 1, 3, 7 e 14 dias (Colorímetro MiniScan EZ; Hunter Lab, Reston, Virgínia, USA). Foram realizadas também as medidas dos parâmetros de cor no bagaço. Foram registrados os valores de L*, a* e b*5 e calculado os valores de Croma (C) e ângulo hue (hº), de acordo com as Equações 1 e 2, respectivamente, além da diferença de cor entre as amostras com adição de bagaço e o controle (ΔE) segundo Di Marzo et al. (2006).

O Croma é a relação entre os valores de a* e b*, onde se obtém a cor real do objeto analisado, enquanto o ângulo hue é o ângulo formado entre a* e b*, indicando a saturação da cor do objeto.

C* = √(𝑎 ∗)2 _{+ (𝑏 ∗)}2 _{(Equação 1)} h* = tan-1 (b*/a*), quando a > 0 (Equação 2) 5.2.4.5 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

Foi utilizado o método descrito por Turner et al. (1954), com pequenas modificações, sendo analisadas as amostras controle, controle 0,2 % de bagaço e controle 2,0 % de bagaço; armazenados durante 1, 7 e 14 dias à 8 ºC. Em béqueres, foram pesados 5 g de cada amostra sendo adicionadas de 25 mL de solução de ácido tricloroacético (7,5 %, p/v). As amostras foram agitadas em Turrax por 2 minutos. Na sequência, foram filtradas (papel de filtro) em balão volumétrico de 25 mL e, após ajuste de volume, 5 mL foram pipetados em tubos de ensaio contendo igual volume de ácido tiobarbitúrico (TBA), sendo levados ao banho maria a 50 °C por 10 minutos. A leitura da absorbância da solução foi realizada em espectrofotômetro a 532 nm. O resultado foi expresso em mg/kg a partir de uma curva padrão construída com tetraetoxipropano [(x = (y + 7,966x10-3)/0,2005; R2 = 0,9998)].

5.2.5 Atividade Antibacteriana

As amostras controle, controle 0,2 % de bagaço, controle 2,0 % de bagaço, hambúrguer 0,2 % de bagaço e hambúrguer 2,0 % de bagaço foram analisados no dia zero e após 24 e 72 h de armazenamento à 8 e 18 ºC. As embalagens dos hambúrgueres foram devidamente

5 _{O parâmetro L representa a luminosidade, com valor de 100 para o branco e 0 para a cor preta; o parâmetro a}

representa a cromaticidade, que varia do vermelho (positivo) ao verde (negativo) e o parâmetro b, que varia da cor amarelo (positivo) ao azul (negativo). Croma (C) = intensidade de cor; ângulo hue (hº) = tonalidade

pesada em frasco contendo 225 mL da água peptonada 0,1 % estéril, sendo homogeneizado manualmente por 1 minuto. As diluições decimais seriadas foram realizadas em tubos com 9 mL de água peptonada 0,1 % estéril.

A atividade antibacteriana das amostras foi avaliada pela enumeração de mésófilos totais e Escherichia coli com a utilização de placas Compact Dry TC e EC (NISSUI Pharmaceutical Co. Ltd., Tóquio, Japão), respectivamente. No centro de ambas as placas foram adicionados 1 mL das diluições selecionadas, seguido de incubação (placas invertidas), a 35 ºC por 24 h.

Os resultados foram expressos em Unidades Formadoras de Colônias (UFC)/g de amostra. Sendo que nas placas de TC, as colônias vermelhas (e as de outras cores), formam em conjunto a contagem total de microrganismos mesófilos. Nas placas de EC, as colônias de E.

coli, apresentam coloração de tom azul à púrpura.

5.2.6 Análise Estatística

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. A diferença entre os grupos foi avaliada segundo ANOVA, seguido do teste de Fischer LSD para avaliação de diferença de médias (p < 0,05), utilizando o software TIBCO® STATISTICA V. 13.2 (Stat- Soft Inc., Tulsa, OK, USA).

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO