Análises histopatológicas

Dos 66 animais, retirados no 15° e 30° dia de experimento, 30 do grupo controle e 36 do tratado em que foram submetidos às análises histológicas em apenas 1 não foram observadas células de Perkinsus sp.. De forma similar ao observado nos animais do estado de saúde inicial (antes do desafio), as células do parasita tinham a forma típica anelada, com grande vacúolo excêntrico. Os trofozoítos do parasita apresentaram tamanhos variando de 2 a 5 µm de diâmetro (n = 40) e estavam presentes no conjuntivo das brânquias e gônada (FIGURA 5A e B) e no epitélio do túbulo digestivo. As células do protozoário também foram observadas em divisão (FIGURA 5C). No entanto, diferente do observado nos animais do estado de saúde inicial (antes do desafio), células de Perkinsus sp. foram observadas algumas vezes fagocitadas (FIGURA 5D). Esta reação de defesa foi observada apenas em dois animais do tratamento. Dias de Experimento T0 T15 Controle Tratamento T30 Controle Tratamento Prevalência (%) 34 (51/150) 47 (8/17) 14,3 (2/14) 21 (4/19) 18,2 (4/22) Abundancia Média 0,46 0,7 0,23 0,21 0,22 Intensidade Média 1,35 1,5 1,5 1 1,25

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Figura 5 – Cortes histológicos de Anomalocardia brasiliana. A – células de Perkinsus sp. infectando o tecido

conjuntivo; B - Perkinsus sp. na gônada masculina; C – Perkinsus sp. em divisão; D - Perkinsus sp. fagocitado. Barra de escala: 10 μm.

Fonte: Arquivo Pessoal (2013)

4.5.4. Confirmação de Perkinsus por PCR

Dos búzios desafiados com células de P. beihaiensis seis foram analisadas por PCR. Destes, 4 (66,7%) produziram fragmentos com tamanho esperado (FIGURA 6), confirmando a presença de Perkinsus. As reações de PCR com o mesmo DNA foram repetidas 3 vezes para as amostras negativas e os resultados foram os mesmos.

A B

D C

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Figura 6 - Gel de agarose (1%) para o diagnóstico molecular de Perkinsus spp. em amostras de Anomalocardia

brasiliana. Detecção da região ITS do rDNA de Perkinsus spp. por PCR. M: marcador molecular (1 Kb Plus Invitrogen); C-: controle negativo (água); C+: controle positivo – amostra infectadas por Perkinsus; Animais 1, 2, 3, 4, 5: amostras positivas.

Fonte: Arquivo Pessoal (2013).

1000 ––– 850 ––– 650 –––

53

5. DISCUSSÃO

O presente trabalho estudou pela primeira vez no Brasil o efeito de um ensaio de infecção experimental utilizando células de Perkinsus beihaiensis no bivalve Anomalocardia

brasiliana do estuário do Rio Jaguaribe, Ceará.

Os hipnósporos de P. beihaiensis da suspensão desenvolveram a zoosporulação após de 2 a 3 dias de incubação em água do mar filtrada estéril. Em um estudo anterior com a mesma espécie de ostra e P. beihaiensis, a zoosporulação também ocorreu neste intervalo de tempo (SABRY et al., 2009). A formação de células em diferentes fases de divisão interna, inclusive algumas contendo zoósporos, evidencia a capacidade proliferativa do parasita e possivelmente sua capacidade de infectar um novo hospedeiro, após sua injeção na cavidade paleal (CHINTALA; BUSHEK; FORD, 2002; CHU; LUNG, 2006; EARNHART et al., 2004; FORD; CHINTALA; BUSHEK, 2002; GOGGIN; SEWELL; LESTER, 1989; SHIMOKAWA, YOSHINAGA; OGAWA, 2010).

Os resultados de detecção de Perkinsus spp. por RFTM nos búzios A. brasiliana antes do desafio mostraram que parte dos animais já se encontrava naturalmente infectada pelo parasita. Este fato demonstra que A. brasiliana é mais uma espécie susceptível à infecção por P. beihaiensis. Ainda, a prevalência de infecção por P. beihaiensis nos búzios observada no presente estudo (34%) foi maior que a mais alta (7,3%) detectada em C. rhizophorae do Estuário do Rio Pacoti (SABRY et al. 2009; 2013), mas e foi similar a observada no sururu

Mytella falcata (36%), também do Estuário do Rio Jaguaribe (PRAXEDES, 2010). Em um

único trabalho anterior utilizando a técnica de RFTM, no búzio A. brasiliana de um banco natural na Reserva Extrativista Marinha do Pirajubaé, Florianópolis, Santa Catarina, os resultados foram negativos (da SILVA et al., 2010).

No presente estudo, a intensidade de infecção por P. beihaiensis variou de muito leve (1) a leve (2). Na ostra C. rhizophorae a intensidade de infecção foi na sua maioria leve (SABRY et al., 2013), no entanto, alguns animais (4 / 26) apresentaram intensidade avançada (SABRY et al., 2009). No sururu M. falcata, a intensidade de infecção foi na maioria muito leve, porém apenas 1 animal (n = 150) apresentou intensidade moderada (PRAXEDES, 2010).

Ainda que não tenha sido feita avaliação da mortalidade natural na população do búzio estudada, não há registros por parte das marisqueiras de diminuição do estoque deste

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recurso. Portanto, com os resultados obtidos quanto a intensidade de infecção média, que foi baixa (1,25), é provável que P. beihaiensis não esteja causando eventos de mortalidade.

As análises dos cortes histológicos dos búzios antes do desafio (T0) realizada

apenas nos animais com nível 2 de intensidade de infecção por P. beihaiensis (máxima observada neste estudo) confirmou todos os casos positivos no RFTM. As células do patógeno apresentaram a forma típica anelada, apresentavam um vacúolo ocupando grande parte do volume interno da célula. Perkinsus sp. aparentemente não causou alterações na estrutura normal dos tecidos, o que contribui para uma hipótese de que o búzio não sofre no ambiente natural com a infecção por este parasita, porém foram detectadas células em estado de divisão.

Ainda que o búzio seja um hospedeiro natural de P. beihaiensis, este estudo quis avaliar o efeito de um desafio com células do parasita, de forma a avaliar a indução a infecção, possíveis alterações histológicas induzidas pela infecção, assim como, indução a mortalidade.

Durante o desafio experimental, ocorreu mortalidade somente até os 11 primeiros dias do desafio e nos animais submetidos à injeção com P. beihaiensis (grupo tratamento). Seria de esperar que os 11 búzios mortos tivessem sofrido algum efeito da infecção pelo parasita, o qual induziu a morte. Curiosamente, após análise por RFTM dos tecidos desses búzios, não se detectou presença de hipnósporos do parasita. Este fato é difícil de explicar, pois tanto os animais controle, como do tratamento foram manipulados da mesma forma e receberam injeção na cavidade paleal de líquido (100 µl). Portanto, fica sem entendimento, a mortalidade ter ocorrido somente nos animais do tratamento.

A prevalência de infecção por P. beihaiensis nos búzios após 15 dias de experimento foi diferente do grupo T0 e entre os dois grupos; houve um aumento no grupo

controle e curiosamente diminuição no grupo tratado com relação ao T0. No entanto, com

relação aos valores de intensidade média de infecção, os dois grupos apresentaram o mesmo (1,5), indicando que houve um efeito da infecção artificial no grupo tratado, pois mesmo que poucos animais tenham sido infectados ou re-infectados, a intensidade de infecção foi maior, ou seja, houve mais indivíduos com o nível 2 (leve). Este fato foi corroborado pela histologia, que mostrou somente no grupo tratado células de P. beiahiaiens em divisão (proliferando), enquanto que no grupo controle mais animais encontravam-se infectados, mas com nível 1 (muito leve).

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Com relação aos 15 dias restantes do experimento (T30), houve uma diminuição

considerável da prevalência e da intensidade média de infecção nos dois grupos. Este fato pode indicar que os búzios após certo período de uma infecção conseguem combater e eliminar o parasita. No grupo controle, a diminuição pode ter sido devida ao fato de estarem em um ambiente sem estresse patológico (água filtrada), sem receber nova carga do parasita provida pelo local. No grupo tratado, a carga parasitária injetada foi eliminada posteriormente (24h) com a troca de água dos tanques. Este fato foi corroborado pelos resultados das análises histológicas, os quais evidenciaram no grupo tratado uma resposta de defesa do hospedeiro, a fagocitose de células de P. beihaiensis pelos hemócitos. Esta reação de defesa não foi observada nos búzios antes do desafio (T0). Células de Perkinsus sp. também foram

observadas fagocitadas em tecidos de C. rhizophorae do estuário do Rio Pacoti (SABRY et

al., 2009). Ostras C. virginica infectadas com P. marinus e ostras C. honkongensis e C. ariakensis afetadas por P. beihaiensis defendem-se dos parasitas mediante a fagocitose

(MACKIN, 1951; MOSS et al., 2008).

Ensaios experimentais com injeção de culturas de trofozoítos na cavidade palial de bivalves tem se mostrado eficientes, mostraram aumento da intensidade de infecção quando comparada ao grupo controle, diferentemente do que ocorreu no presente estudo, onde não possível verificar claramente esta diferença (CHU; LUNG, 2006; EARNHART et al., 2004; FORD; CHINTALA; BUSHEK, 2002).

No presente estudo, a dose do inóculo (125 células) utilizada para infecção foi muito baixa se comparada aos outros estudos. Provavelmente por isto, ela não tenha sido letal para os animais. Chintala, Bushek e Ford (2002) e Goedken et al. (2005) utilizaram uma dose de P. marinus de 106 células/g de tecido, observaram um aumento da intensidade de infecção em relação ao grupo controle. Shimokawa, Yoshinaga e Ogawa (2010) mostraram que a dose letal de P. olseni em Ruditapes philippinarum foi de 107 células de patógeno/g de tecido fresco. Moss, Burreson e Reece (2006) inocularam 105 células de P. olseni / g de tecido fresco, onde obtiveram intensidade de infecção moderada e alta.

Dos 18 búzios do T0 que foram positivos por RFTM, apenas 7 confirmaram a

infecção por Perkinsus por PCR. Dos 6 búzios do desafio somente 4 foram confirmados por PCR. Os resultados negativos possivelmente podem estar relacionados à baixa intensidade de infecção ou outros fatores (REECE; DUNGAN; BURRESON, 2008), por exemplo, a diferença da quantidade de tecido de brânquia utilizado nas duas técnicas; maior nos ensaios de RFTM e bem menor na PCR. Resultados divergentes entre as duas técnicas citadas acima

56

já foram descritos anteriormente (BRANDÃO et al., 2013; SABRY et al., 2009; SABRY et

al., 2013).

Como conclusão, este trabalho avaliou pela primeira vez o efeito de uma infecção artificial de células do protozoário P. beihaiensis no bivalve A. brasiliana e verificou, primeiro, que o búzio já é um hospedeiro natural deste parasita e, segundo, que a infecção pode ser induzida, e ainda que de forma rápida o hospedeiro se recupera de forma eficiente da infecção ativando mecanismos de defesa. O conhecimento do grau de patogenicidade de P.

beihaiensis e da capacidade de defesa de A. brasiliana frente ao patógeno são de suma

importância para ampliar o entendimento da interação parasita-hospedeiro e auxiliar futuramente com medidas de controle da propagação do parasita.

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