Análises In Silico (SNPs)

As análises in silico desenvolvidas neste estudo resultaram na elaboração de um painel de marcadores moleculares para identificação de dezenove espécies de animais, sendo quinze delas silvestres. Para identificação das amostras biológicas e validação do protocolo foram observados através dos alinhamentos, nove polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) que permitiram a geração de perfis de RFLP virtuais espécie-específicos.

Os SNPs têm sido amplamente identificados em seqüências mitocondriais, sendo aplicados em estudos que envolvam autenticação de recursos pesqueiros (BAKER; PALUMBI, 1994; WOLF et al., 2000), detecção de origem de carne bovina (VERKAAR et al., 2001), identificação e distribuição de espécies simpátricas (GONZÁLEZ et al., 2009), taxonomia molecular (TORRES, 2006), entre outros. Então, a identificação dos SNPs nas seqüências de nucleotídeos das espécies aqui estudadas permitiu a geração de fragmentos de restrição específicos e de tamanhos fáceis de serem identificados no gel, reforçando a aplicabilidade dos polimorfismos nucleotídicos da região do Cit b para autenticação de carne de caça ilegal oriunda de espécies ameaçadas e superexploradas.

A partir dos alinhamentos foi possível o desenho dos primers degenerados que amplificaram com sucesso as amostras de espécies silvestres filogeneticamente mais próximas àquelas domésticas, porém quando comparados as seqüências das espécies de répteis (Geochelone carbonaria e Cayman latirostris) com as dos animais domésticos, não foram encontradas regiões de similaridade extensas o suficiente para a elaboração de um único par de primer que amplificasse nas quatro espécies domésticas e na espécie silvestre em análise. A possibilidade de utilizar primers degenerados e enzimas de restrição que digiram preferencialmente apenas as seqüências das espécies silvestres estudadas garante agilidade, segurança e economia nas análises forenses, porém as relações evolutivas entre as espécies devem ser consideradas quando se pretende utilizar esse dispositivo metodológico.

1.6.2 Análises In Vitro

Os resultados obtidos neste estudo permitiram distinguir seis espécies silvestres (Agouti paca, Cebus apella, Dasyprocta leporina, Dasypus novemcinctus, Euphractus sexcinctus, Tayassu tajacu) dos animais domésticos através de perfis moleculares espécie-específico. Este painel molecular é uma ferramenta de identificação segura que permite distinguir produtos de caça de origem ilegal, na ausência de possibilidade de identificação morfológica.

Como era esperado, a variação intra-específica (≤ 10%) foi bem menor que a variação inter-específica. O maior grau de polimorfismo intra-específico foi observado in silico em cateto, porém as amostras biológicas dos mesmos apresentaram o mesmo perfil de RFLP. Também foram observadas regiões dentro das seqüências de Cit b mais conservadas em espécies do mesmo gênero (como em cateto e queixada, por exemplo), o que pode ser explicado pelo pouco tempo de divergência evolutiva entre as espécies (JOHNS; AVISE).

O DNA mitocondrial (mtDNA) é geralmente escolhido para identificação molecular de espécies, pois podem ser obtidos com facilidade em amostras degradadas ou processadas quando comparados ao DNA nuclear (nDNA) principalmente porque o mtDNA está presente em múltiplas copias por célula e o nDNA tem apenas uma cópia oriunda de cada parental (DAWNAY et al., 2007). Além disso, o mtDNA apresenta herança única (materna), ausência de recombinação e apresenta uma alta taxa de mutação, aumentando o poder de discriminação entre as espécies (MALISA et al., 2006).

O gene Cit b tem sido escolhido para identificação molecular de muitos vertebrados tais como, tubarões (KUMAR et al., 2007), baleias (MALIK et al.,1997), tartarugas marinhas (MOORE et al., 2003), serpentes (YAU et al., 2002) e felinos (PRADO et al., 2002; VERMA; SINGH, 2003; WAN; FANG, 2003; RONAGHI et al., 1998).

Foram analisados o maior número de amostras possíveis para confirmação dos perfis espécie-específico esperados pela análise in silico. Só houve uma amostra de porco que apresentou uma mutação no sítio da enzima TfiI, gerando um perfil próximo ao de cabra na análise de cutia. A análise feita pelo algorítimo BLASTn nos permitiu verificar se todos os polimorfismos encontrados nos sítios de restrição das enzimas selecionadas estavam devidamente representados nas seqüências depositadas no banco de dados, e assim, não ocorrerem resultados inesperados ou falso positivo. Para identificar carne de animais silvestres

no nível de certeza aceito em tribunais, é necessário que a probabilidade de erro na identificação seja extremamente baixa, e para isso é importante avaliar um amplo número de amostras e de diferentes áreas geográficas para garantir se as possíveis variantes de cada espécie estejam representadas (MALISA et al., 2006).

Com relação à aplicabilidade das quatro enzimas de restrição utilizadas na análise de PCR/ RFLP (AvaII, BanI, BsiEI, TfiI), apenas a enzima BsiEI não produziu bandas muito claras durante a digestão do DNA de paca e de tatu-galinha, havendo produto de PCR sem ter sido digerido e a geração de um fragmento de baixo peso molecular não detectável no gel de eletroforese. Para a seleção apropriada das enzimas, deve ser considerada a sua capacidade de resolução, correspondida no gel de eletroforese. Em geral, fragmentos menores de 80pb são difíceis de serem identificados em gel de agarose, mesmo que em concentrações mais altas (3% por exemplo) (WOLF et al., 2000).

O objetivo inicial de desenvolver um protocolo de identificação molecular, baseado em seqüências de DNA mitocondrial, para as 15 espécies da fauna brasileira (Agouti paca, Dasyprocta leporina, Cebus apella, Tayassu tajacu, Tayassu pecari, Coendou prehensilis, Myocastor coypus, Dasypus novemcinctus, Euphractus sexcinctus, Pteronura brasiliensis, Trichechus manatus, Dermochelys coriacea, Eretmochelys imbricata, Geochelone carbonaria e Cayman latirostris) esbarrou na dificuldade de obtenção de um par de primers degenerados suficientes para amplificar amostras de répteis (Geochelone carbonaria e Cayman latirostris) e mamíferos, e na dificuldade de obtenção de amostras biológicas, seja pela raridade das espécies em cativeiro (ariranha, ouriço-caixeiro e ratão-do-banhado, por exemplo), ou pelas dificuldades burocráticas dos mantenedores (peixe-boi e tartarugas marinhas).

As espécies envolvidas nesse estudo representam animais que são amplamente caçados em todo o território nacional, tais como o tatu galinha (Dasypus novemcinctus) e a paca (Agouti paca) (FREITAS; SILVA, 2005).

Como observado, os resultados das análises in silico puderam ser corroborados com os das análises in vitro gerando os mesmos perfis de RFLP para cada espécie estudada.

Considerando a fidelidade dos dados encontrados nos bancos públicos e a robustez das ferramentas de bioinformática, espera-se que os polimorfismos encontrados para as demais espécies em questão sejam existentes, constituindo um protocolo passível de utilização.

O presente estudo reforça o potencial de polimorfismos do gene Cit b como poderosos marcadores para identificação de espécies, especialmente aquelas ameaçadas. Os dados

obtidos podem ser úteis como ferramentas em conservação no combate a caça predatória e monitoramento do comércio ilegal de carne de caça e de seus produtos.

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CAPÍTULO 3