Análises laboratoriais

No laboratário do SDASM, sob a orientação da médica veterinária, Drª Filomena Medeiros, após a separação do soro, uma parte deste, foi usada para os testes de Rosa de Bengala, no rastreio à brucelose, e a outra foi enviada para o Laboratório Regional de Veterinária (LRV) em Angra do Heroismo, onde se procederam aos testes laboratoriais para a pesquisa de anticorpos à leptospirose, clamidiose, IBR, BVD e Neospora caninum. Também seguiram para o LRV os soros positivos ao Rosa de Bengala para o teste de Fixação de Complemento. Considerou-se efectivo contaminado a manada que, ao ser rastreada, apresente animais com resultados positivos ao TFC.

2.1.3.1. Brucelose

Teste de Rosa de Bengala

O TRB efectua-se em placa, onde se misturam volumes iguais de soro e de antigénio. A reacção deste antigénio com os eventuais anticorpos presentes na amostra de soro ensaiada, leva à formação e visualização de complexos imunes ao fim de 4 minutos. A interpretação dos resultados é baseada na presença ou ausência de aglutinação (Regulamento CE nº 535/2002 de 21/3/2002 e Decreto-Lei nº 227/2004, de 7/12/2007). A sensibilidade do teste é elevada de 98,1% e a especificidade é paralela (EFSA, 2006).

Os resultados são dados da seguinte forma:

Resultado Negativo – soro sem qualquer aglutinação ao fim dos 4 minutos (-).

Resultado Positivo – soro com qualquer grau de aglutinação até ao fim de 4 minutos (+, ++, +++).

Teste de Fixação de Complemento

O TFC às amostras positivas ao teste Rosa de Bengala, foi realizado sob a orientação do Sr. Engº Zootécnico Marco Barros. Baseia-se na detecção e quantificação de anticorpos anti-Brucella fixadores de complemento.

Na primeira fase deste teste, ao soro problema é-lhe adicionado uma quantidade fixa de antigénio. Se estiverem presentes anticorpos no soro formam-se complexos imunes antigénio-anticorpo. Junta-se de seguida o complemento. Se os complexos antigénio- anticorpo estão presentes, o complemento será fixado e não poderá reagir na segunda fase. Na etapa final as células indicadoras (glóbulos vermelhos de carneiro) e uma quantidade de anticorpos anti-eritrócitos (hemolisina) são adicionados á prova. Se restou complemento, os eritrócitos serão lisados e a reacção é negativa; se o complemento foi totalmente consumido pelos complexos imunes, os eritrócitos não serão lisados e a reacção é positiva. O grau de hemólise surgido em consequência da lise globular é a base para a interpretação dos resultados. O grau de hemólise é comparado com valores standardizados de 0, 25, 50, 75 e 100%. Os resultados devem ser expressos em unidades internacionais do teste de fixacção de complemento (ICFTU) calculado em relacção ao obtido em titulação paralela ao de um trabalho com um soro nacional standartizado calibrado contra o soro standart internacional da OIE (OIEISS) que contenha 1000 ICFTU (OIE, 2002).

O “cut-off” utilizado foi de 20 ICFTU/ml com uma sensibilidade de 96% e uma especificidade semelhante (EFSA, 2006). São considerados positivos todos os soros cujo grau de hemólise, surgido em consequência da lise globular, tenha sido igual ou superior a 20 (OIE, 2002).

2.1.3.2. Leptospirose

Na pesquisa de anticorpos anti-Leptospira, realizado sob a orientação da Srª Engª. Zootécnica Sandrine Resende, foi utilizada a técnica de aglutinação microscópica (TAM), preconizado pela OMS como método de referência para a pesquisa de anticorpos anti- Leptospira (base do diagnóstico) e classificação serológica de estirpes isoladas (OMS, 1987).

Este teste baseia-se na observação do grau de aglutinação do soro suspeito, após sua diluição em soro fisiológico (Cloreto de Sódio 8,5g e 1000 ml de água destilada) a 1:50 com um conjunto de estirpes patogénicas de referência que apresentam uma elevada reactividade dentro do mesmo serogrupo, e, por outro lado, uma reactividade cruzada mínima com serogrupos heterólogos (OMS, 1987). O rastreio serológico deve ser efectuado a baixas diluições de soro (OMS, 1987 e Collares-Pereira, 1992, in LRV, 2007). O serovar Hardjo, para uma diluição de 1:100, apresenta uma sensibilidade de 0,41 e especificidade de 1.0 (Ellis e Little, 1986 in LVR, 2007).

Neste teste os dois principais factores que intervêm na reprodutibilidade inter ou intra- laboratorial são a densidade do antigénio e a interpretação do ponto terminal da reacção (OMS, 1987). O ponto terminal da reacção é definido como a maior diluição final do soro que apresente 50% ou mais leptospiras aglutinadas, i.e., até 50% de leptospiras livres. Inicialmente, os soros foram rastreados numa diluição de 1:100 e só depois se procedeu à titulação seriada até à diluição de 1:3200 dos soros positivos frente aos antigénios aglutinantes (quando existiam 50% ou mais de leptospiras aglutinadas) e para a determinação do título final-última diluição que apresentou até 50% das leptospiras livres. Os soros polireactivos foram considerados com todas as diluições dos diferentes serovares aos quais eram positivos.

2.1.3.3. Clamidiose

O teste à clamidiose foi executado pela Engª Zootécnica Sandra Benevides pela técnica de ELISA indirecto com o KIT comercial Ruminants Serum Chlamydiosis da marca LSI (Laboratoire Service Internacional) Lissieu, França cujas bases gerais foram enunciados no ponto 1.3.3.4. Diagnóstico da clamidiose.

De acordo com o fabricante contactado específicamente para este assunto pelo LRV, o método é mais sensível e menos específico do que o teste de fixação de complemento, não tendo sido, no entanto, possível obter, concretamente, os valores de sensibilidade e especificidade deste teste.

Assim, os resultados foram obtidos de acordo com as fórmulas propostas pelas instrucões do fabricante (Ruminants serum chlamydiosis LSI KIT).

O cálculo do rácio S/P das amostras foi determinado segundo a fórmula seguinte, onde DO é a densidade óptica:

S/P = (DO amostra – DO média controlo negativo) / (DO média controlo positivo –DO média controlo negativo)

Os resutados podem ser expressos por títulos de acordo com a fórmula: Título = S/P x 100

Para títulos negativos é possível obter S/P ou título negativo.

Os resultados são válidos quando a DO média controlo positivo é maior que 0,400 e quando a DO média controlo positivo é maior que 2 vezes a DO média controlo negativo.

Os resultados foram classificados como positivos ou negativos de acordo com a Tabela 6. Tabela 6 – Critérios de interpretação dos resultados segundo o rácio S/P obtido em amostras de soro, na pesquisa de anticorpos da Chlamydiae abortus

Título Interpretação Título ≤ 25 Negativo 25 < Título ≤ 35 Positivo + 35 < Título ≤ 60 Positivo ++ 60 < Título ≤ 100 Positivo +++ Título > 100 Positivo ++++