ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

Os ensaios microbiológicos foram realizados com a finalidade de determinar a eficiência antimicrobiana dos compostos de PEAD e PA6 contendo ou não os aditivos biocidas e irradiados ou não irradiados..

Para tanto, foram realizados testes qualitativos (método de discos- difusão em ágar) com os corpos de prova polímero/aditivo e aditivos puros irradiados. Também foram realizados testes quantitativos de Concentração Inibitória Mínima com os aditivos puros.

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Os testes foram realizados antes e após a exposição à radiação γ, de maneira a identificar possíveis alterações na capacidade biocida das amostras. Os testes foram realizados com dois tipos de cepas de bactérias: Escherichia coli (E. coli) e Staphylococcus aureus (S. aureus), gram-negativa e gram-positiva, respectivamente.

Ainda foram realizados testes com leveduras, de forma a avaliar o desempenho antimicrobiano antes e após a irradiação também em fungos. Nesse caso, optou-se por adaptar uma técnica utilizada no controle de processo de fermentação nas indústrias de bebidas e de álcool combustíveis que consiste na avaliação do comportamento de curvas de atenuação. Mais detalhes sobre a técnica estão no item 3.4.1.3.

3.4.1.1 Difusão em ágar

Os testes de difusão em ágar foram aplicados nesse trabalho com o objetivo avaliar o efeito da concentração dos aditivos na eficiência antimicrobiana do PEAD e da PA6, bem como avaliar também o efeito da irradiação sobre a propriedade antimicrobiana dos polímeros.

A técnica de difusão em ágar adaptado é um teste qualitativo, onde as amostras a serem testadas são colocadas sobre uma superfície de ágar previamente semeada com um determinado microrganismo, de maneira homogênea em uma placa de petri. Uma vez prontas, as placas de petri são devidamente acondicionadas em uma estufa a 37 °C por 18 h. Durante esse período, o agente antimicrobiano poderá difundir-se para o ágar e impedir o crescimento do microrganismo. Essa região é chamada de halo de inibição e tem seu diâmetro médio associado diretamente com a eficiência biocida. (FIORI, 2008). Porém, esta análise somente é possível quando ocorrer à difusão dos princípios ativos e quando for possível fazer a leitura da região de inibição com boa resolução.

3.4.1.2 Concentração Inibitória Mínima - CIM

A CIM é uma técnica que tem como objetivo determinar a quantidade mínima do agente antimicrobiano necessária para inibir o crescimento microbiano em um determinado meio. Neste trabalho foram utilizados 6 tubos de ensaio contendo 10 ml de BHI (Brain Heart

Infusion) e neles bacteriana ajustada a

108 CFU/ml pelo padrão de turvação MacFarland. Na sequência foram adicionadas 0,346g de polímero aditivado com uma concentração diferente, ou seja, 0,0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5%. Cada amostra teve então

sua turbidez medida por um espectrofotômetro ajustado para um comprimento de onda de 640nm nos intervalos de 4, 8 e 24h. Esses testes foram realizados tanto para o PA6 quanto para o PEAD, irradiados e não irradiados e em todas as concentrações testadas.

3.4.1.3 Redução do nível de atenuação provocada pelos aditivos puros

A curva de atenuação é um parâmetro de controle muito utilizado nas indústrias de produção de bebidas fermentadas (principalmente vinho e cerveja) e de álcool etílico, para avaliar a evolução do processo de fermentação. Baseia-se no fato de que, à medida que o processo de fermentação avança, o açúcar presente na solução aquosa é consumido pelas leveduras é convertido em álcool etílico e gás carbônico.1 A construção dessa curva é feita medindo-se o teor de açúcar em função do tempo e plotando-se em um gráfico.

Essa medida do teor de açúcar é usualmente feita de maneira indireta, medindo-se a densidade ou o índice de refração. A medida da densidade deve-se é feita, pois as soluções aquosas tem sua densidade aumentada à medida que a concentração do soluto aumenta. Essa medida é feita utilizando um densímetro ou alcoômetro, que permite uma leitura rápida da densidade da solução.

A desvantagem desse método é a necessidade de certo volume de solução, que normalmente fica em torno de 200 ml por medida, o que inviabiliza sua utilização em amostras pequenas. Já a medida do índice de refração baseia-se na mudança do índice de refração da uma solução, à medida que a concentração do soluto aumenta. O índice de refração é definido como a relação entre a velocidade da luz atravessando um meio e a velocidade da luz no vácuo, resultando em um número adimensional e é medido em equipamentos chamados refratômetros.

Os refratômetros geralmente usam apenas algumas gotas da solução, o que permite seu uso para medidas de amostras de pequenos volumes, além de atingir o equilíbrio térmico com o equipamento rapidamente, obtendo-se medidas mais precisas. Para facilitar a medida dos teores de açúcar em frutas e bebidas, diversas escalas foram desenvolvidas, ente elas Platô, Baumé, Balling e Brix. A escala Brix foi

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No caso dessas indústrias, essa solução é na verdade um extrato vegetal contendo altos teores de sacarose, glicose ou frutose, além de outras substâncias naturais presentes nas plantas utilizadas, esse extrato é chamado

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criada por Adolf Ferdinand Wenceslaus Brix é uma das mais utilizadas é definida como a quantidade em gramas de açúcar, presente numa determinada massa de solução aquosa de sacarose, ou seja, uma medida de 30°Brix indica uma solução de 30g de açúcar em 100 g de solução aquosa.

A inclinação das curvas de atenuação, bem como os valores iniciais e finais da concentração de açúcar, permite avaliar a eficiência das leveduras no processo. Diversos fatores podem avaliar essas características nas curvas de atenuação, tais como temperatura, concentração inicial de açúcar, presença de sais dissolvidos, tipos de leveduras e a presença de substâncias nocivas às mesmas.

Nesse trabalho, foram utilizadas leveduras Saccharomyces Cerevisiae (r.f bayanus) e todas as demais variáveis foram mantidas constantes, variando-se apenas a concentração de agente antimicrobiano adicionado a solução, dessa forma, pode-se avaliar a influência de possíveis degradações provocadas pela irradiação.

3.4.1.3.1 Preparação das soluções

Essa técnica baseia-se na avaliação da curva de atenuação do teor de açúcar de uma levedura Saccharomyces Cerevisiae (r.f bayanus) em uma solução aquosa de sacarose em função do tempo.

Para essa análise, foram preparadas soluções de sacarose de 100g/l em peso (10,2°Bx). Neste caso, foram pesados 130g de sacarose e dissolvidos em cerca de 1000 ml de água mineral, da marca “Da Guarda”. Em seguida adicionou-se a levedura hidratada (conforme item 3.4.1.3.2) e completaram-se os 1300 ml da solução aquosa também com água mineral. Optou-se pelo uso de água mineral, devido à exigência da presença de sais minerais para o desenvolvimento das leveduras.

Essa solução inicial foi dividida em 13 alíquotas de 100 ml cada, sendo: uma sem aditivo para controle, seis para o Triclosan (irradiado e não irradiado) e mais seis para os para o vidro dopado com Zn (irradiado e não irradiado). Para cada aditivo, as amostras foram divididas em dois grupos de três alíquotas cada. Em cada alíquota foram adicionados 2, 4 e 8 mg de cada aditivo irradiado e não irradiado, obtendo-se concentrações de 20, 40 e 60mg/l (Figura 14-II). Em seguida cada alíquota foi dividida em duas amostras para servir de prova e contraprova (Figura 14-III) e levadas à estufa a 23°C, de acordo com as indicações do fornecedor da levedura, para o inicio e desenvolvimento da fermentação. Um resumo das amostras preparadas é mostrado na Tabela 5.

Tabela 5 - Resumo das amostras preparadas para a análise das curvas de atenuação

Triclosan Vidro Controle

Concentração

(mg/l) 20 40 60 20 40 60 0

Irradiado 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml

2 x 50 ml Não irradiado 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml 2 x 50 ml

Figura 14 - Esquema de preparação das amostras para determinação das curvas de atenuação

3.4.1.3.2 Reidratação da levedura

O processo de preparação das soluções iniciou-se com a reidratação das leveduras. A recomendação do fabricante é que sejam utilizados dez volumes de água para cada volume de levedura seca. Foram preparados 600 ml para cada tipo de aditivo e, 150 ml para o controle, totalizando 1300 ml. Assim, foram utilizados 40 ml de água destilada a 35 °C para cada 4,0 g de levedura seca.

A mistura foi mantida em agitação por 10 min, em descanso por mais 10 min e novamente em agitação por 10 min. Uma vez reidratada, a levedura foi adicionada ao mosto preparado simultaneamente em procedimentos a parte, conforme Figura 14-I.

É importante ressaltar que todo o processo de hidratação e a quantidade de levedura para cada volume de água foi realizado conforme as instruções do fabricante.

3.4.1.3.3 Armazenamento e medida do grau Brix

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temperatura de 23°C durante todo o período de análise. O nível de açúcar foi medido utilizando um refratômetro portátil com compensação de temperatura da marca Homis, modelo 32ATC-K. As medidas foram feitas a cada doze horas totalizando 8 medidas de cada amostra (4 dias).